4.3. Structure du récepteur nicotinique
Le récepteur nicotinique de l’organe électrique et du muscle squelettique des vertébrés est un pentamère composé de quatre sous-unités distinctes (a, b, g et d) dans le rapport stœchiométrique de 2:1:1:1, respectivement. Dans les plaques terminales des muscles matures et innervés, la sous-unité g est remplacée par e, une sous-unité étroitement apparentée. Les différentes sous-unités sont identiques à environ 40% dans leurs séquences d’acides aminés, provenant d’un gène primordial commun. Le récepteur nicotinique est devenu le prototype d’autres canaux ioniques ligandés pentamériques, dont les récepteurs des acides aminés inhibiteurs (acide g-aminobutyrique et glycine) et certains récepteurs de la sérotonine (5-HT3). Chacune des sous-unités du récepteur pentamérique a une masse moléculaire de 40 000 à 60 000 daltons. Les 210 résidus amino-terminaux constituent la quasi-totalité du domaine extracellulaire. Il est suivi de quatre domaines transmembranaires (TM) ; la région située entre les troisième et quatrième domaines constitue la majeure partie du composant cytoplasmique. Chacune des sous-unités du récepteur nicotinique de l’ACh a une exposition extracellulaire et une exposition intracellulaire sur la membrane postsynaptique. Les cinq sous-unités sont disposées autour d’un pseudo-axe de symétrie pour circonscrire un canal situé à l’intérieur,.
Le récepteur est une molécule asymétrique (14 nm×8 nm) de 250 000 daltons, avec la majeure partie du domaine non membranaire sur la surface extracellulaire. Dans les zones de jonction (c’est-à-dire la plaque terminale motrice du muscle squelettique et la surface ventrale de l’organe électrique), le récepteur est présent à des densités élevées (10 000/mm2) dans un ordre d’emballage régulier. Cet ordonnancement des récepteurs a permis la reconstruction par image de microscopie électronique de sa structure moléculaire. Une protéine de liaison à l’ACh homologue au seul domaine extracellulaire du récepteur nicotinique a été identifiée chez les escargots d’eau douce et d’eau salée et caractérisée structurellement et pharmacologiquement.
Cette protéine s’assemble sous forme d’un pentamère homomère et lie les ligands du récepteur nicotinique avec la sélectivité attendue ; sa structure cristalline révèle une organisation atomique attendue du récepteur nicotinique. De plus, la fusion de la protéine de liaison à l’ACh et des travées transmembranaires du récepteur donne une protéine fonctionnelle qui présente le déclenchement du canal et les changements d’état attendus du récepteur. Cette protéine de liaison sert à la fois de substitut structurel et fonctionnel du récepteur et a permis de comprendre en détail les déterminants qui régissent la spécificité du ligand du récepteur nicotinique. Les sites de liaison des agonistes se trouvent aux interfaces des sous-unités, mais dans le muscle, seules deux des cinq interfaces de sous-unités, a g et a d, ont évolué pour lier les ligands. La liaison des agonistes, des antagonistes compétitifs réversibles et de la toxine elapid a est mutuellement exclusive et implique des surfaces superposées sur le récepteur. Les deux sous-unités formant l’interface des sous-unités contribuent à la spécificité du ligand. Les mesures des conductances membranaires démontrent que les taux de translocation des ions sont suffisamment rapides (5×107 ions par seconde) pour nécessiter une translocation des ions par un canal ouvert plutôt que par un transporteur d’ions en rotation. En outre, les modifications de la perméabilité ionique induites par les agonistes (généralement un mouvement vers l’intérieur, principalement de Na+ et secondairement de Ca2+) se produisent par un canal cationique intrinsèque à la structure du récepteur. La deuxième région transmembranaire de chacune des cinq sous-unités forme le périmètre interne du canal. Le site de liaison de l’agoniste est intimement couplé à un canal ionique ; dans le récepteur musculaire, la liaison simultanée de deux molécules agonistes entraîne un changement rapide de conformation qui ouvre le canal. La réponse de liaison et la réponse de déclenchement présentent toutes deux une coopérativité positive. Les détails sur la cinétique de l’ouverture du canal sont issus des techniques de patch-clamp électrophysiologiques qui distinguent les événements individuels d’ouverture et de fermeture d’une seule molécule de récepteur et confirment que les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR) sont des canaux ioniques ligandés pentamériques composés de sous-unités comprenant un domaine extracellulaire qui porte le site de liaison au ligand et un domaine distinct de pores ioniques. La transduction du signal résulte du couplage allostérique entre les deux domaines ; la distance entre le site de liaison et la porte du domaine du pore est de 50 Å. Cependant, les études de liaison aux récepteurs sont spécifiques des récepteurs cholinergiques nicotiniques qui ont été réalisés sur des épithéliums vestibulaires isolés des grenouilles Rana catesbiana et Rana temporaria. L’article présente des preuves de la présence de récepteurs cholinergiques nicotiniques spécifiquement associés aux zones sensorielles et étudie la liaison de conformations atypiques d’agonistes nicotiniques conférant une sélectivité de sous-type et conclut que le nAChR joue un rôle crucial dans la neurotransmission excitatrice et constitue une cible importante pour les médicaments et les insecticides. Divers sous-types de nAChR avec diverses combinaisons de sous-unités conférant une sélectivité différentielle pour les médicaments nicotiniques, et a également identifié une famille de gènes codant pour des protéines homologues à la sous-unité α du récepteur nicotinique de l’acétylcholine musculaire dans le génome du rat. Ces gènes sont transcrits dans les systèmes nerveux central et périphérique dans des zones connues pour contenir des récepteurs nicotiniques fonctionnels. Le rôle joué par les récepteurs nicotiniques neuronaux β2 (nAChRs) dans la médiation des effets secondaires de la nicotine chez le fœtus et le nouveau-né. Des souris gravides WT et mutantes dépourvues de la sous-unité β2 nAChR ont été implantées avec des minipompes osmotiques qui délivraient soit de l’eau soit une dose contrôlée de nicotine. Par la suite, on a observé une comparesion du développement du système sympathoadrénal et des réflexes de respiration et d’éveil de la progéniture peu après la naissance, une période de vulnérabilité accrue à l’exposition à la nicotine. D’autre part, les néonicotinoïdes, comme l’imidaclopride, sont des agonistes des nAChR dotés d’une puissante activité insecticide. Depuis son introduction au début des années 1990, l’imidaclopride est devenu l’un des insecticides les plus utilisés tant pour la protection des cultures que pour la santé animale, la base moléculaire de la résistance à l’imidaclopride, cinq sous-unités nAChR (Nlα1-Nlα4 et Nlβ1) ont été clonées à partir de Nilaparvata lugens. Une comparaison des gènes des sous-unités nAChR provenant de populations sensibles et résistantes à l’imidaclopride a permis d’identifier une seule mutation ponctuelle à une position conservée (Y151S) dans deux sous-unités nAChR, Nlα1 et Nlα3. Une forte corrélation entre la fréquence de la mutation ponctuelle Y151S et le niveau de résistance à l’imidaclopride a été démontrée par PCR spécifique à l’allèle. Par l’expression de nAChRs hybrides contenant les sous-unités α de Nilaparvata lugens et β2 de rat, des preuves ont été obtenues qui démontrent que la mutation Y151S est responsable d’une réduction substantielle de la liaison spécifique à l’imidaclopride. Cette étude fournit des preuves directes de l’apparition d’une résistance au site cible d’un insecticide néonicotinoïde, et étudie la nature du site de liaison cation-π dans le récepteur nicotinique. Elle conclut que le récepteur nicotinique de l’acétylcholine est le prototype du canal ionique dépendant du ligand. Un certain nombre d’acides aminés aromatiques ont été identifiés comme contribuant au site de liaison de l’agoniste, ce qui suggère que les interactions cation-π peuvent être impliquées dans la liaison du groupe ammonium quaternaire de l’agoniste, l’acétylcholine. La conformation des molécules cholinergiques au niveau des récepteurs nerveux nicotiniques, et trouve une corrélation des analyses des structures cristallines des puissants agonistes nicotiniques que sont l’acétylcholine, l’acétyl-α-méthylcholine, la lactoylcholine, la 1,1-diméthyl-4-phénylpipérazine et la nicotine permet de déterminer la conformation des agonistes cholinergiques pertinents pour les récepteurs nerveux nicotiniques. L’expression des récepteurs de neurotransmetteurs codés par des ARNm isolés de trois lignées cellulaires de gliomes humains. Les ovocytes injectés avec des ARNm provenant de deux lignées cellulaires de glioblastome n’ont pas présenté de réponses électriques aux différents neurotransmetteurs testés.
Modulation des nAChR par la strychnine constate que la strychnine est un antagoniste puissant et sélectif des récepteurs de la glycine qui s’est avéré inhiber les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AcChoRs) musculaires (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ, et α 1β 1δ) et neuronaux (α 2β 2 et α 2β 4) exprimés dans des ovocytes de Xénope. La strychnine seule (jusqu’à 500 µmol/L) n’a pas provoqué de courants membranaires dans les ovocytes exprimant les AcChoRs, mais lorsqu’elle a été appliquée avant, en même temps ou pendant la superfusion d’acétylcholine (AcCho), elle a rapidement et réversiblement inhibé le courant provoqué par l’AcCho (courant AcCho). La traduction de l’ARN messager exogène codant pour les nAChRs produit des récepteurs fonctionnels dans les oocytes de Xenopus. Dans cette étude, l’ARN messager extrait de l’organe électrique de Torpedo a été injecté dans des oocytes de Xenopus. Cela a conduit à la synthèse et à l’incorporation de récepteurs fonctionnels de l’acétylcholine dans la membrane de l’ovocyte. Lorsqu’ils ont été activés par l’acétylcholine, ces récepteurs d’acétylcholine du Torpedo dans la membrane de l’ovocyte ont ouvert des canaux dont la perméabilité ionique ressemblait à celle des récepteurs nicotiniques dans d’autres cellules.
La localisation des récepteurs de l’acétylcholine (AChR) à la surface des cellules myogéniques en développement des muscles latissimus dorsi antérieur et postérieur de l’embryon de poulet en relation avec le processus d’innervation a été étudiée au niveau ultrastructural en utilisant un conjugué peroxydase de raifort-α-bungarotoxine. Des concentrations localisées d’AChR ont été trouvées dans de petites régions de 0,1-0.4 µm de largeur à la surface des cellules myogéniques de muscles âgés de 10 à 14 jours. Les effets de l’acétylcholine et des agents qui imitent ou bloquent ses actions physiologiques ont également été étudiés en fonction des concentrations de guanosine 3′ :5′-monophosphate cyclique (GMP cyclique) et d’adénosine 3′:5′-monophosphate cyclique (AMP cyclique) dans des tranches de cortex cérébral, de ventricule cardiaque et d’iléon de mammifères. L’acétylcholine, et les agents cholinomimétiques ayant une action muscarinique prédominante, tels que la méthacholine, le bethanechol et la pilocarpine, ont induit et une augmentation de la concentration de GMP cyclique ou une légère diminution de la concentration d’AMP cyclique, dans les trois tissus étudiés.
Les propriétés fonctionnelles et la localisation cellulaire du récepteur neuronal humain α7 AcCho (α7 AcChoR) et de sa forme mutée (mut) L248T ont été étudiées en les exprimant seuls ou sous forme de fusions génétiques avec la version améliorée de la protéine fluorescente verte (GFP). Les ovocytes de Xenopus injectés avec les ADNc de la sous-unité de type sauvage, mutα7 ou chimérique ont exprimé des récepteurs qui déclenchent des courants membranaires lorsqu’ils sont exposés à AcCho. Comme déjà connu, les courants AcCho générés par les récepteurs wtα7 décroissent beaucoup plus rapidement que ceux suscités par les récepteurs mutα7. Interaction des récepteurs nicotiniques β2 et des voies de la dopamine dans le contrôle de la locomotion spontanée, et trouve l’acétylcholine (ACh) est un modulateur connu de l’activité des neurones dopaminergiques (DAergiques) par la stimulation des nAChRs. Pourtant, la composition en sous-unités et la localisation spécifique des nAChRs impliqués dans la locomotion médiée par la DA restent à établir in vivo. Les souris dépourvues de la sous-unité β2 des nAChRs (β2KO) présentent une hyperactivité frappante en champ libre, ce qui suggère un déséquilibre de la neurotransmission DA. Cependant, une mutation au sein du domaine M2 du récepteur nicotinique fait passer la 5-Hydroxytryptamine d’un antagoniste à un agoniste. L’étude a porté sur les effets de la 5-hydroxytryptamine (5HT) sur les récepteurs nicotiniques neuronaux homomériques (nAcChoR) exprimés dans des ovocytes de Xénope après injection d’ADNc codant pour la sous-unité de type sauvage. L’AcCho a provoqué de grands courants qui ont été réduits par la 5HT de manière réversible et dose-dépendante, avec une concentration demi-inhibitrice et un coefficient de Hill. Bien que l’étude du récepteur cholinergique des lymphocytes T cytotoxiques et des agonistes cholinergiques ait la capacité des lymphocytes sensibilisés à blesser les cellules portant les alloantigènes sensibilisants, le récepteur cholinergique de la population de lymphocytes attaquants a été étudié avec la manipulation pharmacologique d’un système in vitro qui quantifie la blessure médiée par les cellules attaquantes sensibilisées sur les cellules cibles.