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L’isolement de l’ADN des tissus végétaux peut être très difficile car la biochimie entre les espèces végétales divergentes peut être extrême. Contrairement aux tissus animaux où le même type de tissu provenant de différentes espèces a généralement des caractéristiques similaires, les plantes peuvent avoir des niveaux variables de métabolites et de biomolécules structurelles. Les polysaccharides et les polyphénols sont deux classes de biomolécules végétales qui varient considérablement d’une espèce à l’autre et qui sont très problématiques lors de l’isolement de l’ADN. Les polysaccharides et les polyphénols contaminants peuvent interférer avec les manipulations de l’ADN après son isolement.
Il existe des méthodes qui éliminent efficacement les polysaccharides et les polyphénols des préparations d’ADN végétal. L’utilisation de CTAB (bromure de cétyl triméthylammonium), un détergent cationique, facilite la séparation des polysaccharides pendant la purification tandis que des additifs, tels que la polyvinylpyrrolidone, peuvent aider à éliminer les polyphénols. Les tampons d’extraction à base de CTAB sont largement utilisés lors de la purification de l’ADN à partir de tissus végétaux.
Une option pour purifier l’ADN en utilisant le CTAB exploite le fait que les polysaccharides et l’ADN ont des solubilités différentes dans le CTAB en fonction de la concentration de chlorure de sodium. À des concentrations de sel plus élevées, les polysaccharides sont insolubles, tandis qu’à des concentrations plus faibles, l’ADN est insoluble. Par conséquent, en ajustant la concentration en sel dans les lysats contenant du CTAB, les polysaccharides et l’ADN peuvent être précipités de manière différentielle.
Les polyphénols sont des composés qui contiennent plus d’un cycle phénolique (par exemple, le tanin), une structure qui se lie très efficacement à l’ADN. Ils sont naturellement présents dans les plantes, mais sont également générés lorsque les plantes présentent des dommages tissulaires (brunissement). Lors de l’homogénéisation des tissus végétaux, les polyphénols sont synthétisés par la polyphénol oxydase libérée. L’ajout de polyvinylpyrrolidone empêche l’interaction de l’ADN et des anneaux phénoliques en liant les polyphénols.
Les protocoles basés sur le CTAB ont tendance à fonctionner très bien, mais un inconvénient important est que les extractions au chloroforme sont couramment utilisées pour séparer les molécules organiques solubles de l’ADN. Le chloroforme étant cancérigène, de nombreuses institutions désapprouvent son utilisation. Ainsi, une méthode alternative qui évite le chloroforme a été développée par OPS Diagnostics ; elle se trouve sur la page du kit d’extraction d’ADN végétal Synergy™.
Matériaux
- Tampon CTAB : 2 % de bromure de cétyltriméthylammonium, 1 % de polyvinylpyrrolidone, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, ou tampon d’extraction CTAB
- Centrifugeuse (jusqu’à 14 000 x g)
- Solution de RNase A
- Isopropanol
- Éthanol à 70 %
- Tubes de centrifugation de 2 ml
- SpeedVac
- Tampon TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Méthode
Les échantillons de plantes peuvent être préparés en broyant cryogéniquement les tissus dans un mortier et un pilon après refroidissement dans l’azote liquide. Les plantes lyophilisées peuvent être broyées à température ambiante. Dans les deux cas, une poudre fine est la meilleure pour extraire l’ADN.
- Pour chaque 100 mg de tissu homogénéisé, utiliser 500 µl de tampon d’extraction CTAB. Mélanger et faire un vortex complet. Transférer l’homogénat dans un bain à 60°C pendant 30 minutes.
- Après la période d’incubation, centrifuger l’homogénat pendant 5 minutes. à 14 000 x g.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 5 µl de solution de RNase A et incuber à 37°C pendant 20 minutes
- Ajouter un volume égal de chloroforme/alcool isoamylique (24:1). Vortexer pendant 5 secondes puis centrifuger l’échantillon pendant 1 minute à 14 000 x g pour séparer les phases. Transférer la phase supérieure aqueuse dans un nouveau tube. Répétez cette extraction jusqu’à ce que la phase supérieure soit claire.
- Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Précipiter l’ADN en ajoutant 0,7 volume d’isopropanol froid et incuber à -20°C pendant 15 minutes.
- Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 10 minutes. Décanter le surnageant sans déranger le culot et laver ensuite avec 500 µl d’éthanol 70 % glacé. Décanter l’éthanol. Éliminer l’éthanol résiduel en le séchant dans un SpeedVac.
- Séchez le culot suffisamment longtemps pour éliminer l’alcool, mais sans sécher complètement l’ADN. Dissoudre l’ADN dans 20 µl de tampon TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Le culot peut avoir besoin d’être réchauffé afin de se dissoudre.
Protocole optionnel:
L’utilisation de colonnes de spin en silice peut donner un ADN de meilleure qualité. Pour un protocole optionnel, cliquez ici.