Synthèse asymétrique de la batrachotoxine : Les toxines énantiomères montrent une divergence fonctionnelle contre le NaV

Les effets phénotypiques des poisons aigus trouvés parmi la riche pharmacopée de la vie terrestre et marine ont été documentés depuis l’antiquité. L’isolement et la caractérisation des composés toxiques ont permis de disposer d’importants réactifs chimiques pour étudier des circuits biochimiques complexes (1). Les études de ce type ont révélé un grand nombre d’agents peptidiques et de petites molécules qui ciblent les canaux ioniques sodiques voltage-dépendants (NaV), une classe obligatoire de protéines membranaires pour la signalisation bioélectrique (1-4). Parmi la collection de modulateurs NaV connus, on trouve trois agents structurellement apparentés, la (-)-batrachotoxine, la vératridine et l’aconitine (Fig. 1A) – des dérivés aminés lipophiles de grande taille dont on pense qu’ils partagent un site de liaison commun dans la région du pore interne du NaV (3) (site 2, Fig. 1B). L’influence de ces toxines sur le déclenchement des ions diffère cependant de façon distincte. D’un côté, (-)-BTX, le principal constituant toxique des grenouilles de plomb colombiennes (genre Phyllobates), est un agoniste complet de NaV, provoquant une ouverture plus rapide du canal à des potentiels de membrane hyperpolarisés et bloquant l’inactivation rapide (entre autres effets caractéristiques) (3-5). À l’inverse, les activités de la vératridine et de l’aconitine sont mieux décrites comme un agonisme partiel et une inhibition de la fonction du canal, respectivement (5). Malgré les connaissances récentes de la biologie structurale sur l’architecture tridimensionnelle des NaV procaryotes (6-9), une compréhension moléculaire de l’influence des toxines du site 2 sur la conduction ionique et la cinétique de la porte ionique fait défaut. Les études structure-activité des toxines, combinées à des expériences de mutagenèse des protéines, peuvent répondre aux questions liées à la nature dynamique de la fonction des canaux et peuvent guider la conception rationnelle de modulateurs à petites molécules de l’activité des NaV (1). La puissance de (-)-BTX (10), son histoire légendaire en tant qu’archétype de la petite sonde moléculaire du site 2 (4), et ses effets inégalés sur la porte du canal en font un composé « principal » optimal pour de telles recherches.

(-)-BTX se liant aux NaVs altère chaque aspect de la fonction du canal, résultant en un décalage hyperpolarisé de la dépendance de tension de l’activation, une inhibition de l’inactivation rapide et lente, une diminution de la conductance du canal unique et une réduction de la sélectivité ionique (3, 4). L’utilité de ce produit naturel en tant qu’activateur du NaV a conduit à une diminution substantielle de l’approvisionnement mondial, qui dépassait autrefois 1 g mais était inférieur à 170 mg en 2009 (11, 12). Depuis que la toxine a été isolée pour la première fois en 1963 par Märki et Witkop à partir de grenouilles venimeuses collectées dans la forêt pluviale du nord de la Colombie (13), Phyllobates a été placé sur la liste des espèces menacées, et la collecte de (-)-BTX naturel à partir de cette source est donc limitée. Le (-)-BTX a également été identifié dans certaines espèces d’oiseaux (genres Pitohui et Ifrita) (14) et de coléoptères (genre Choresine) (15), mais seulement en petites quantités (par exemple, ~1,8 μg de (-)-BTX par coléoptère). Bien que des synthèses semi-(16) et racémiques (17) de BTX-A (Fig. 1C), un composé dépourvu de l’ester de pyrrole C-20, aient été divulguées, la longueur de chacun de ces travaux (>45 étapes linéaires) empêche la production facile de (-)-BTX ou d’analogues sélectionnés. Par conséquent, notre désir d’utiliser la BTX et ses formes modifiées pour examiner la dynamique des canaux et les mécanismes de passage des ions a motivé nos efforts pour obtenir le produit naturel par synthèse de novo.

L’analyse rétrosynthétique de la (-)-BTX nous a conduit à esquisser un plan qui permettrait l’assemblage tardif du cycle E homomorpholine et l’élaboration de l’ester allylique C-20 (Fig. 1C), facilitant ainsi l’accès aux formes modifiées de la toxine. Des études antérieures sur la relation structure-activité utilisant un petit nombre de dérivés semi-synthétiques de BTX (10, 18) et d’analogues de BTX à cycle C/D/E (19) ont révélé l’importance de l’ester C-20, de l’amine tertiaire et du squelette tétracyclique pour l’activité agoniste du NaV. Le démêlage du BTX-A expose un cadre 1 de type stéroïde, dont l’assemblage est confondu par deux groupes angulaires à la jonction C/D-ring, l’exo-méthylène C-11 et l’alcène C-8/C-9. Pour maximiser la convergence dans notre plan de synthèse, nous avons conçu une stratégie de déconnexion pour 1 à travers le cycle C. Cette idée réduirait le problème de la construction de la structure 1. Cette idée permettrait de réduire le problème de la construction de 1 en deux fragments, l’un exprimant le système du cycle A/B (3, 20) et le second comprenant le cyclopentane du cycle D (4, 21). L’exécution réussie de ce schéma pourrait produire la toxine désirée par une séquence d’étapes linéaires ne totalisant pas plus de 20 à 25.

Notre synthèse de (-)-BTX a commencé par le couplage de la méthylènecyclopentanone 4 (21) (fig. S1A) et du bromure de vinyle 3, obtenu à partir de la (S)-(+)-Hajos-Parrish cétone par une séquence modifiée d’étapes initialement décrites par Parsons et ses collaborateurs (20) (fig. S1B). La jonction des fragments 3 et 4 pour générer le tricycle A/B/D lié 5 a représenté le premier d’une série de défis pour le développement du procédé. Une première tentative pour effectuer cette transformation impliquait l’échange Li-Br de 3 avec n-BuLi (Bu, butyle) et l’addition séquentielle de l’énone 4. Bien que 5 ait été obtenu dans ces conditions, les rendements en produits n’ont jamais dépassé 30 %. Des expériences de quenching du deutérium avec D2O ont validé notre hypothèse selon laquelle l’α-déprotonation de 4 était compétitive avec la voie d’addition de la cétone souhaitée. Des réactions de transmétallation des espèces vinyl-lithium avec ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, éthyle), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluorométhanesulfonate), CeCl3-2LiCl et LaCl3-2LiCl ont été examinées, mais aucune de ces mesures ne s’est avérée efficace (22, 23). L’addition d’un équivalent de LiBr anhydre au milieu réactionnel de 3 a amélioré l’efficacité du couplage de >20% (24). En suivant cette piste, un protocole optimisé utilisant 2,1 équivalents de t-BuLi, qui génère vraisemblablement un équivalent de LiBr in situ, a permis d’obtenir de manière reproductible 5 sous la forme d’un seul diastéréoisomère avec un rendement de 65 % à l’échelle du multigramme. La facilité de synthèse de ce matériau et de sa forme désilylée 6 a permis des efforts ultérieurs pour identifier les conditions d’annulation en tandem du cycle C et l’installation du centre quaternaire C-13.

Une évaluation des méthodes disponibles pour la fermeture du cycle des 1,6-énynes nous a conduit à envisager des processus initiés par des radicaux (25). Dans de telles conditions, un radical C-13 3° naissant pourrait être intercepté pour forger l’unité aminométhylène angulaire (ou un substitut approprié). Les efforts pour examiner d’abord la formation du cycle C sur 6 ont toutefois révélé l’erreur potentielle de ce plan. L’utilisation de n-Bu3SnH et de triéthylborane (Et3B) pour favoriser l’événement de cyclisation a abouti à la génération de deux isomères, 7 et 8, dans un rapport 1:5 favorisant le produit non désiré (Fig. 2A). Des études menées par Stork et Beckwith et leurs collègues ont démontré que la concentration du substrat et la température de la réaction peuvent influencer le mode de cyclisation (c’est-à-dire 5-exo-trig ou 6-endo-trig) dans les réactions enyne à médiation radicalaire (26, 27). A température élevée (130°C) et avec une dilution cinq fois plus importante de 6, une inversion de la sélectivité a été observée, permettant un léger excès du tétracycle désiré (rapport 1,3:1 de 7 à 8 ; Fig. 2A). Le rendement de produit combiné de cette transformation a dépassé 90 %, ce qui encourage la poursuite de l’exploration de cette chimie, malgré les résultats modestes de sélectivité.

Des tentatives répétées de capturer le radical intermédiaire C-13 avec des dérivés d’oxime et d’hydrazone générés à partir du formaldéhyde n’ont pas permis d’obtenir le produit d’aminométhylation attendu (28). Forcés d’envisager des solutions alternatives, nous avons reconnu qu’un groupe éther silylique modifié ajouté à l’alcool C-14 voisin serait bien placé pour intercepter le radical 3° (29). Sur la base des précédents disponibles, un chlorure d’alcynylsilyle, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, méthyle), a été choisi pour modifier l’alcool en C-14 dans 6 (30, Fig. 2A). Le traitement du silyléther résultant (9) avec n-Bu3SnH et Et3B à 150°C a entraîné une cascade de cyclisation pour donner le pentacycle 10 comme produit exclusif (31). Dans les limites de la détection par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H), aucun isomère du cycle C à cinq chaînons correspondant n’a été généré dans ce processus. Nos efforts préliminaires pour comprendre le rôle des groupes substituants C-14 sur la sélectivité de la réaction suggèrent que la protection silyle de l’alcool (ainsi que les températures élevées de la réaction) favorise la fermeture du cycle 6-endo-trig. Bien que des études supplémentaires soient justifiées pour apprécier ces données de sélectivité de structure, notre cascade de cyclisation enyne offre une approche convergente pour synthétiser des échafaudages stéroïdes substitués et devrait faciliter l’accès à une large gamme de tels composés.

Une inspection minutieuse des produits de cyclisation radicale dérivés de 6 ou 9 a révélé un résultat inattendu concernant la structure de la fraction organostannane résultante (Fig. 2, A et B). La carbostannylation du groupe alcyne devrait donner un produit vinyl-étain, comme on l’a noté dans la réaction de 6. De façon inattendue, lorsque 9 a été soumis aux conditions de réaction, l’allylstannane 10 a été le seul produit, un résultat confirmé à la fois par RMN et par cristallographie aux rayons X. La formation de l’allylstannane 10 peut être rationalisée par un mécanisme impliquant le transfert de l’atome 1,4-H d’un radical vinyle intermédiaire (32) (Fig. 2B), une proposition soutenue par une expérience de marquage au deutérium (fig. S5). Bien que ce résultat n’ait pas été planifié, l’efficacité et la sélectivité de la réaction de cyclisation nous ont contraints à prendre la décision d’avancer ce matériau. Dans l’avenir, la polyvalence du groupe allylstannane devrait servir les efforts futurs pour préparer des BTX modifiés par le cycle C.

La disponibilité de 10 en neuf étapes à partir de la cétone Hajos-Parrish a permis la production de quantités substantielles de matériel pour compléter la synthèse cible. L’excision de l’éther silylique de pontage dans 10 a été accomplie avec un excès de n-Bu4NF, révélant un intermédiaire diol qui a ensuite été avancé à 11 par oxydation d’alcool médiée par l’acide 2-iodoxybenzoïque et clivage chimiosélectif du vinylsilane (57% ; Fig. 2B). La conversion de l’aldéhyde 11 en chloroacétamide 12 a été réalisée en suivant une séquence en trois étapes, en un seul ballon (16, 33). A partir de 12, la fermeture efficace du cycle homomorpholinamide avec NaOEt (92%) (17) a fourni un intermédiaire polyvalent pour la modification des unités des cycles C et D. Cette dernière a pu être réalisée par l’intermédiaire du cycle D de l’homomorpholinamide. Cette dernière a pu être réalisée par le triflate d’énol du cycle D, préparé en utilisant KN(SiMe3)2 et PhNTf2.

L’introduction de l’alcool C-11α à partir de l’allylstannane du cycle C 13 a présenté l’un des défis les plus difficiles dans notre approche du BTX (Fig. 2B). Bien que la protodestannylation de 13 pour générer l’exo-méthylènecyclohexane C-11 correspondant ait eu un succès limité (34), toutes les tentatives ultérieures d’oxyder ce composé en cétone 15 (c’est-à-dire O3, OsO4 et RuO4) n’ont pas donné de produit. Inspirés par un rapport de Kim et Fuchs, nous avons tenté de convertir 13 en chlorure d’allyle correspondant en utilisant CuCl2 (35). Heureusement, la conduite de cette réaction dans le dioxane dans des conditions aérobies a permis d’obtenir l’énal 14 avec un rendement de 85 % et une quantité mineure de produit chloré (~10 %). Bien que les détails mécanistiques de cette transformation restent peu clairs, nous ne connaissons qu’un seul autre exemple documenté d’une telle réaction d’oxydation, qui utilise un catalyseur au vanadium et de l’O2 (36). L’énal 14 est convenablement disposé pour la conversion en cétone C-11 15 en suivant une série d’étapes d’interconversion de groupes fonctionnels mises en évidence par un réarrangement de Curtius (37). L’absence d’un chromophore viable sur la batrachotoxine A (BTX-A) rend difficile la purification de cette matière ; par conséquent, dans la séquence menant à 15, le méthoxyacétal en C-3 a été échangé avec l’alcool p-méthoxyphénéthylique.

La complétion du squelette carboné du (-)-BTX a été réalisée par un couplage croisé catalysé par le palladium du tributyl(1-éthoxyvinyl)étain au triflate de vinyle 15 (Fig. 3A) (38). L’hydrolyse in situ de l’éther d’énol naissant avec de l’acide oxalique 1 M a fourni l’énone 16 (77%). Après une sélection poussée d’agents réducteurs, la réduction globale stéréosélective de l’énone 16 a été réalisée avec un rendement de 33 % par traitement avec de l’AlH3 fraîchement préparé (39). Nous émettons l’hypothèse que le lactame basique de Lewis (ou une forme réduite) agit comme un élément pivot de stéréocontrôle, car le traitement de l’énone 15 avec des agents réducteurs hydrides alternatifs a fourni exclusivement l’alcool C-11β indésirable. L’utilisation de AlH3 a également favorisé la génération de l’épimère d’alcool allylique C-20 correct, un résultat stéréochimique qui peut être rationalisé par un modèle invoquant le contrôle de la chélation (38). La déprotection du produit de la réduction de l’AlH3 dans des conditions acides a permis d’obtenir (-)-BTX-A avec un rendement de 83 % (17). Enfin, en utilisant une modification du protocole d’acylation du (-)-BTX-A de Tokuyama, Daly et Witkop avec l’anhydride mixte préparé à partir du chloroformiate d’éthyle et de l’acide 2,4-diméthyl-pyrrole-3-carboxylique (10), la synthèse de 2 mg de (-)-BTX a été complétée (79 %, rendement global de 0,25 %) en 24 étapes à partir de la cétone (S)-(+)-Hajos-Parish. Le produit était identique en tous points à un échantillon de la matière naturelle et aux données spectroscopiques enregistrées précédemment (40, 41). Notre plan de synthèse a également permis la préparation à l’échelle du milligramme de l’antipode de la toxine non naturelle, le (+)-BTX, l’ester benzoate connu du (-)-BTX-A (BTX-B ; Fig. 3B) (42, 43), et l’énantiomère de ce composé (ent-BTX-B).

La caractérisation électrophysiologique du (-)-BTX et du BTX-B synthétiques contre le NaV1.4 de rat (rNaV1.4) a confirmé que ce dernier fonctionne également comme un agoniste et est similaire en puissance au produit naturel (fig. S6 et tableau S12). Des rapports précédents et nos propres études indiquent que le groupe ester du BTX-B est plus stable que l’acylpyrrole du BTX, sensible à l’oxydation ; des expériences supplémentaires ont donc été réalisées avec le premier composé (42, 43). Le BTX-B synthétique a été testé contre un sous-ensemble d’isoformes NaV représentatives, notamment rNaV1.4, NaV1.5 humain et NaV1.7 humain. L’application de 10 μM de BTX-B à des cellules ovariennes de hamster chinois exprimant un seul sous-type de NaV a entraîné un courant sodique soutenu dans tous les cas (figure 4A et figures S7 et S8). L’agonisme dépendant des isoformes de NaV par BTX-B a empêché l’inactivation à l’état d’équilibre de >80% de la population de canaux sodiques (Fig. 4A et fig. S8). BTX-B a également induit un décalage hyperpolarisant caractéristique (-44,9 à -51,5 mV) dans le voltage semi-maximal (V0,5) de l’activation des isoformes NaV de type sauvage (Fig. 4B et tableau S13). La similitude de ces données est cohérente avec la conservation élevée de la séquence protéique entre les sous-types de NaV dans les hélices S6 internes qui bordent le pore et forment le site de liaison putatif de la toxine (fig. S9).

Suite à des travaux antérieurs de notre laboratoire (19) et d’autres (44, 45), nous nous sommes demandé si la forme énantiomère du BTX se lierait avec une haute affinité au NaV avec des effets fonctionnels analogues. On ne peut répondre à cette question que si l’on dispose d’une synthèse de novo de la toxine. En conséquence, des enregistrements électrophysiologiques avec l’ent-BTX-B ont été effectués contre rNaV1.4. Ces données ont révélé que l’ent-BTX-B est un antagoniste de canal dépendant de l’utilisation et de l’état, avec une concentration inhibitrice semi-maximale mesurée de 5,3 ± 0,6 μM . La concentration pour l’inhibition semi-maximale du NaV par l’ent-BTX-B est similaire en magnitude à la concentration efficace semi-maximale pour l’agonisme du BTX-B (1,0 ± 0,1 μM ; fig. S10) mesurée dans des conditions identiques. Notamment, contrairement à l’antipode naturel, la liaison ent-BTX-B n’a provoqué qu’un déplacement minime de la V0,5 d’activation et de la V0,5 d’inactivation à l’état d’équilibre (tableau S14). En outre, le blocage du canal était entièrement réversible par cet inhibiteur.

Pour déterminer si BTX-B et ent-BTX-B partagent un site de liaison chevauchant dans la région du pore interne de NaV, ent-BTX-B a été testé contre cinq mutants à point unique rNaV1.4 qui ont été montrés précédemment pour déstabiliser la liaison BTX (Fig. 4, E et F, et fig. S12) (19). La mutation de N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) et N1584 (48) en lysine a entraîné une diminution de ~3 à 30 fois du blocage du courant par 5 μM d’ent-BTX-B. Contre F1236K (49), cependant, l’ent-BTX-B a conservé une activité significative (inhibition du courant de 33,6 ± 2,1 %). La différence évidente entre ent-BTX-B et BTX-B indique une région de liaison chevauchante, mais non identique, dans la cavité du pore interne. Il semblerait que le canal ouvert soit suffisamment large pour accueillir des ligands amine tertiaire lipophiles (19, 45, 50). Des altérations subtiles de la position de liaison de ces ligands semblent modifier considérablement la réponse fonctionnelle de la protéine. Les recherches futures viseront à délimiter les interactions précises canal-toxine qui distinguent l’activation de l’inhibition par les dérivés du BTX et les toxines lipophiles apparentées.