12 mai 2018
Une question commune que les scientifiques se posent toujours lorsqu’ils obtiennent le signal d’un dosage basé sur les anticorps est : « Ce signal représente-t-il vraiment la présence et la quantité de ma protéine ? »
La spécificité des anticorps est toujours une préoccupation pour les scientifiques. Même s’il existe un certain nombre de méthodes de validation qui ont été utilisées pour le test de spécificité, les données sont souvent sur-interprétées. Les données de recherche de divers groupes ont montré que certains anticorps monoclonaux couramment utilisés sur le marché ne sont en fait pas mono-spécifiques. Ils peuvent réagir de manière croisée avec d’autres protéines.Et cette réactivité croisée peut induire en erreur les chercheurs avec des résultats faussement positifs, et potentiellement causer des effets secondaires inattenduset des rapports de diagnostic erronés pour les cliniciens.
Donc, quels sont les contrôles que nous devrions utiliser pour la validation de la spécificité des anticorps ?
Les lignées cellulaires et les tissus qui expriment les protéines cibles en grande quantité peuvent être utilisés comme contrôles positifs pour la validation des anticorps.Il peut s’agir d’une protéine endogène ou d’une protéine surexprimée codée par un clone d’ADNc. Cependant, un contrôle positif ne pourra pas confirmer la spécificité de l’anticorps. Vous pouvez voir une bande de la bonne taille ou une coloration positive dans le bon emplacement subcellulaire, mais tout cela pourrait être des signaux faussement positifs provenant de la réactivité croisée des anticorps. Donc normalement pour la validation d’un anticorps, un contrôle négatif est nécessaire pour l’évaluation de la liaison non spécifique.
La validation par knockout est jusqu’à présent le meilleur contrôle négatif pour l’évaluation de la spécificité de l’anticorps. Dans la validation knockout,l’anticorps est testé sur une lignée cellulaire knockout qui n’exprime pas la protéine cible. Depuis 2017, OriGene s’est associé à EdiGene, un innovateur CRISPR, pour produire des cellules doublement knockout à haut débit. Contrairement à la lignée cellulaire knockout d’Horizon, les lignées cellulaires knockout d’OriGene proviennent de lignées cellulaires couramment utilisées, telles que HEK293T ou HeLa, ce qui rend le produit plus pertinent pour les chercheurs.Dans cette lignée cellulaire double knockout, la cible de l’anticorps n’est pas présente car le gène codant pour la protéine est éliminé ou « knocked out ». Les échantillons des cellules knockout et des cellules parentales (type sauvage) sont testés côte à côte contre le même anticorps, et si l’anticorps est vraiment spécifique, il ne devrait détecter le signal spécifique que dans la cellule de type sauvage, mais pas dans la lignée cellulaire knockout. En utilisant les lysats de ces cellules knockout, nous avons validé plus de 100 anticorps monoclonaux (anticorps validés KO). La validation des knockouts est censée offrir un véritable contrôle négatif pour le test de spécificité des anticorps.
Mais la validation des knockouts est-elle suffisante pour confirmer la monospécificité d’un anticorps ? Je retiendrais cette conclusion avec prudence.Tout d’abord, les effets hors cible des cellules knockout ne sont pas bien étudiés à ce stade. Ainsi, une cellule knockout peut non seulement éliminer l’expression de la protéine qui vous intéresse, mais aussi éliminer ou réduire l’expression d’une autre protéine, qui peut être une protéine présentant une réaction croisée avec l’anticorps. Ainsi, le signal négatif ne signifie pas toujours que l’anticorps ne réagira pas avec d’autres protéines que la protéine d’intérêt. Deuxièmement, les tests avec des cellules/tissus knock-out ne sont possibles que pour les protéines non essentielles. Pour les protéines essentielles, le knockout est impossible. Donc, pour ces protéines, vous aurez besoin d’un autre moyen de tester la spécificité de l’anticorps.
Il y a plusieurs années, OriGene a développé une méthode de réseau de protéines pour le test de spécificité des anticorps. Avec la plus grande collection au monde de lysats de surexpression, nous avons fabriqué une puce à protéines unique qui contient >10k protéines humaines surexprimées en double sur une seule lame de verre recouverte de nitrocellulose. Cette technologie de micro-puces à protéines a été utilisée pour valider la spécificité de nombreux anticorps monoclonaux OriGeneUltraMAB™. En augmentant le nombre de protéines sur la puce, la réactivité croisée d’un anticorps peut être étudiée plus en détail sur l’ensemble du protéasome humain.
En résumé, le test de spécificité des anticorps est assez compliqué. Il doit être validé par de multiples outils et directions.Au fur et à mesure que la technologie continue de progresser, nous disposerons de plus d’atouts précieux et de procédures standardisées pour la validation des anticorps.Les scientifiques ne seront plus confrontés à la même question lorsqu’ils obtiendront des signaux positifs de leurs essais basés sur les anticorps.