Eredmények és megvitatás
Vízminőségi paraméterek – hőmérséklet (28.2 ± 0,2ºC), oldott oxigén % (107,4 ± 0,8), pH (7,9 ± 0,1), összes ammóniás nitrogén (2,8 ± 0,0mg.L-1), ionizálatlan ammónia (0,004 ± 0,001mg.L-1) nitrit-nitrogén (0.08±0,01mg.L-1) és nitrát-nitrogén (1,19±0,06mg.L-1) – a halak jóléte és természetes fejlődése szempontjából megfelelőnek ítélték (Boyd, 1990).
A króm-oxid a legelterjedtebben használt inert marker az állatokkal végzett táplálkozási vizsgálatokban, és a takarmányok lehetővé teszik annak értékelését és a kiegyensúlyozott étrendek pontos összeállítását. A Cr3+ teljes visszanyerését oxid formában a radioaktív izotópos technikával igazolták (Kane et al., 1959), és ezért ebben a vizsgálatban 51Cr2O3 (99,99%-os tisztaság) formájában használták.
Az 51Cr-t azért használták ebben a vizsgálatban, hogy megelőzzék a króm takarmányban, akváriumvízben, ürülékben és a halak szövetmintáiban történő visszanyeréséből eredő esetleges hibákat, mivel lehetővé teszi a közvetlen, egyszerű, érzékeny és pontosabb elemi mérést a mintaanyagban, csökkentve a kémiai elemzéshez kapcsolódó torzításokat, különösen az emészthetőségi és táplálkozási vizsgálatokban. Mindezeket a tényezőket gondosan figyelemmel kísérték és ellenőrizték ebben a vizsgálatban, így az eredmények kizárólag a kezelés hatásainak tulajdoníthatók. A 2. táblázat a kontroll- és kísérleti halakból gyűjtött mintákban kimutatott 51Cr specifikus aktivitásainak logaritmikus transzformáció után megállapított eredményeit, szórását és regressziós paramétereit mutatja be a gyűjtési idő (napok) függvényében. A regressziókat a szögletes és lineáris együtthatókon keresztül hasonlítottuk össze (Ostle és Mensing, 1975).
2. táblázat. A kontroll és kísérleti halak mintagyűjteményében kimutatott 51Cr specifikus aktivitások logaritmikus transzformációja és azok, amelyeket a regressziós görbék beállításához használtunk.
| Begyűjtött minta | A gyűjtés napja | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
| Kontrollhalak | ||||||||
| Vér (BC) | 1.00±0.01A | 1.00±0,01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | |
| Kísérleti halak | ||||||||
| Vér (BE) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | |
| Renális szövet (RT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 |
| Izomszövet – Filé (MT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 |
| Májszövet (LT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.00 | 1.01±0.01 | |
| Visceralis zsír (VF) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 |
| Bél tartalom nélkül (I) | 1,06±0.04 | 1.19±0.05 | 1.30±0.05 | 1.49±0,12 | 1,82±0,03 | 1,89±0,0,27 | 2,22±0,11 | |
| Gyomor tartalom nélkül (S) | 1,05±0,03 | 1,20±0,06 | 1.22±0.04 | 1.33±0.10 | 1.56±0.21 | 1.92±0.27 | 2.19±0.03 | |
| Koponyaszövet (GT) | 1.06±0.03 | 1.10±0.03 | 1.20±0.02 | 1.33±0.05 | 1.45±0.09 | 1.66±0.11 | 1.85±0.05 | |
| Aquariumi víz (WA) | 1.04±0.06 | 1.27±0.04 | 1.48±0.03 | 1.62±0.04 | 1.74±0.03 | 1.83±0.03 | 1.87±0.06 | |
| Az emésztőrendszer (széklet) tartalma (CTDE) | 1.18±0.08 | 1.81±0.38 | 2.60±0.28 | 3,75±0.24 | 4,26±0.31 | 5.07±0.15 | 5.83±0,04 | |
AValeus öt ismétlés átlaga (szórás).
Annak vizsgálatára, hogy van-e króm III felszívódás a halakban, mint például a króm-oxid, egyszerű lineáris regressziókat állítottunk be – gyűjtési napok vs. meghatározási együtthatók a kontroll és kísérleti halak mintáira (1. ábra). A kísérleti tápot nem kapott halszövetmintákból mért háttérértékek – 10 000 számlálás öt intervallumban – átlagosan 98,02±3,61cpm voltak, és ezeket kivontuk a kontroll és kísérleti halminták összes leolvasási értékéből.
1. ábra. A kontroll- és kísérleti halak mintagyűjteményei radioaktív aktivitásának (cpm) becsült értékeinek korrigált lineáris regressziói logaritmikus transzformáció után az expozíciós idő (napok) függvényében.
A háromértékű króm (pl. kloridok, fluoridok, foszfátok, nitrátok és hidroxidok) bélrendszeri felszívódása mind az emberekben, mind az állatokban alacsony, az étrendi beviteltől függően körülbelül 0,5 és 2,0% között változik. Egyes adatok arra utalnak, hogy a króm felszívódása fordítottan arányos az étrendi bevitellel (Anderson és Kozlovsky, 1985). Ebben a kísérletben a táplálékhoz hozzáadott króm-oxid szintje mindössze 0,01% volt, és a fent említett szerzők szerint ennél a kis mennyiségnél a króm fokozott felszívódáshoz vezetne az emésztőrendszerben, és ezért könnyebben kimutatható lenne a kísérleti halmintákban.
A hét napon át kontrolltáplálékkal etetett halak, kontroll állatok vérmintáinak korrigált regressziója a kísérleti táplálékkal etetett halak mintáival korrigált regresszióval összehasonlítva nem különbözött egymástól (P>0,05). Ezek az eredmények megegyeznek Utley és munkatársai (1970) eredményeivel, akik szintén radioaktív króm(III)-oxidot alkalmaztak orálisan, de szarvasmarháknak adva, és nem mutattak ki sugárzást az üszők vérében. Más vizsgálatok az 51CrCl3 gyors átjutási sebességéről számoltak be a gyomor-bél traktuson keresztül (Oberleas és Stoecker, 1987) és az 51Cr gyors csúcsértékéről patkányok vérében (Hopkins Junior, 1965), és a vérben lévő szintek a króm (III) bevitelt tükrözik. Ezért, ha a króm-oxidok elszenvedik a gyomor-bél traktuson keresztül történő felszívódást, jelenlétüket gyorsan kellene kimutatni a halak vérében ebben a vizsgálatban.
A vérben a felszívódott króm (III) főként transzferrinhez és más fehérjékhez kötődik, amelyek felelősek a szervezetben történő szállításáért. A hosszú távú tárolás különösen a májban, a lépben, a csontokban és más szervekben történik (Lim és mtsai., 1983). A króm felhalmozódási sorrendje a következő: vese > máj > kopoltyú H” izom, alacsonyabb koncentrációk esetén (Palaniappan és Karthikeyan, 2009).
Ha az inert marker formájában lévő krómot a nílusi tilápia felszívta, ez az ásványi anyag felhalmozódik a halszövetekben. Ezért annak megállapítására, hogy történt-e a króm marker formájában történő felszívódása, a nílusi tilápia emésztőrendszerén keresztül, a vérmintákat összehasonlítottuk a kontrollhalakból származó korrigált regresszióval, a kísérleti tápot kapott halak zsigeri zsír, májszövet, izomszövet és veseszövet regresszióval korrigált mintáival, és ezek nem különböztek egymástól (P>0,05), és így egyetlen lineáris regresszióhoz tartozónak jellemezhetők. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kísérleti halak mintáiban nem mutattak ki radioaktivitást, ami arra utal, hogy a marker felvétele nem jelentős.
A króm bélrendszeri felszívódásáért felelős mechanizmus nem jól ismert. Nem világos, hogy a Cr passzívan vagy a bélnyálkahártyán található hordozófehérjék segítségével szívódik-e fel. Mertz és munkatársai (1965) reposztálták, hogy a trivalens Cr felszívódása nem tűnik telítődő folyamatnak, ami arra utal, hogy passzív diffúzióval szívódik fel. Mertz és Roginski (1971) ezzel ellentétes bizonyítékokról számolt be. Azt találták, hogy az evertált bélzsákok által felszívódó háromértékű króm százalékos aránya csökkent, ahogy a Cr koncentrációja nőtt az inkubációs közegben. Ez a megfigyelt telítődési hatás arra utal, hogy a Cr felszívódásában hordozófehérjék is részt vesznek. Dowling és munkatársai (1989) kísérletében azonban arra a következtetésre jutottak, hogy a szervetlen, háromértékű króm a Cr-nek megfelelő táplálékkal táplált patkányok vékonybelében a passzív diffúzió nem közvetített folyamatával szívódik fel.
Febel és munkatársai (2001) eredményei szerint egy óra alatt 2,5% króm-oxid szívódott fel, és a felszívódott króm a májba került, ahol a májszövet a króm-oxid 10,9%-át visszatartotta. Ezek az eredmények eltérnek a jelen vizsgálat eredményeitől, úgy gondoljuk, ez azért van, mert nem volt jelentős növekedés a króm 51Cr a halak elemzett szöveteiben: vér, zsigeri zsír, máj, vese és a halak fájlja, ami nem történt, ami a marker felszívódására és ebből következő bioakkumulációjára utal. Ami a kísérletek között különbözött, az az akváriumban a halak életének megfelelő körülmények fenntartására alkalmazott rendszer, a táplálékhoz adott marker koncentrációja és a halfajok voltak.
Az egyik lehetséges magyarázat az, hogy a króm-oxid nem inert marker, és hogy a króm – króm-oxid vagy más, az emésztés során keletkező krómszármazékok formájában – jelentős mértékben felszívódik a bélfalon keresztül (Fernandez et al., 1999). Egy másik magyarázat, amelyet Ng és Wilson (1997) javasolt Shiau és Liang (1995) eredményeinek magyarázatára, a halak kopoltyúin keresztül történő lehetséges beépülése az akváriumvízben lévő krómnak, amely abból ered, hogy a halak krómtartalmú ürüléküket az akváriumvízbe ürítik. Még az akváriumvíz hatékony cseréje esetén is megnő a króm koncentrációja, ami az ásványi anyag felszívódását eredményezi (Fernandez et al., 1999).
A kísérletben statikus rendszerrel, mindennapos akváriumok szifonozásával csökkentették a maradékok mennyiségét, valamint a takarmány és az ürülék felhalmozódásának elkerülését a vízben, és csak a párolgás és a gazdálkodás miatt elvesztett vizet állították vissza. Ez az eljárás az akvárium vizében és a kopoltyúmintákban az ásványi anyag krómkoncentrációjának és vezetésének lineáris növekedését okozta. A felhalmozódás az expozíciós időtartammal és a környezeti koncentrációval változik. Alacsony koncentráció esetén a felhalmozódás összhangban volt az expozíciós idővel (Palaniappan és Karthikeyan, 2009).
A vízi környezetben található nehézfémek (pl. kobalt, réz, mangán, molibdén, cink és króm) kritikus aggodalomra adnak okot a vízi szervezetekben való felhalmozódásuk miatt (Dimari et al., 2008). A halakat, amelyek a legtöbb vízi élőhely fő alkotóelemei, a szervetlen ásványi anyagok jó bioakkumulátoraiként is felismerték (King és Jonathan, 2003). A kopoltyúról is beszámoltak, mint a nehézfémek bejutásának fontos helyéről, ami kopoltyúelváltozásokat és károsodást idéz elő (Bols et al., 2001). E hipotézis további tesztelése érdekében ebben a kísérletben a kísérleti halak táplálékába adagolt 51Cr2O3 koncentrációja 100 µg.g-1 volt, 58,2 µCi fajlagos aktivitással. Ezért, ha az elem felszívódott volna a halak emésztőrendszeréből, esetleg az akvárium vizében lévő kopoltyúkon keresztül történő beépüléssel vagy bármilyen más úton, akkor legalább az 51Cr csökkenéséből származó gama-sugárzást kellett volna kimutatni a nílusi tilápiában.
A meghatározott regressziók során a kontroll halakból vett vérmintákat szembeállították azokkal, amelyek a kísérleti tápot kapott halak béltartalom nélküli, gyomortartalom nélküli, emésztőrendszeri tartalom nélküli béltartalomból gyűjtött minták eredményeit képviselik, és a megállapított regressziók között lineáris növekedést és szignifikáns különbségeket észleltek (P<0,05). Ezek a kapott eredmények arra utalnak, hogy a bél tartalom nélkül, a gyomor tartalom nélkül és az emésztőrendszer tartalma a hét napos kísérleti időszak alatt telítődést eredményezett.
A Clawson és munkatársai (1955) által kapott eredmények azt mutatják, hogy a króm-oxid koncentrációja a székletben az elfogyasztott takarmányéval egyensúlyba kerül három és négy nappal a vegyület kezdeti etetése után. Ebben a vizsgálatban azonban a hetedik napig megnövekedett a marker koncentrációja a bélsárban, ez a különbség a kísérletben használt marker alacsony koncentrációjának és az emésztőrendszer szükséges telítettségének tudható be.
A jelen vizsgálatban kapott eredményeket figyelembe véve egyetértünk Fernandez et al. (1999) véleményével, hogy a Shiau és Liang (1995), valamint Shiau és Shy (1998) által kapott eredmények másik lehetséges magyarázata az lenne, hogy a halak krómtartalma ugyanazt a mintát követi, mint amit ők más szervetlen tápanyagok (kalcium, foszfát, hamu) esetében találtak: a króm-oxiddal kiegészített táppal etetett halakban növekszik a koncentrációja, és 5-10 g.kg-1 körüli króm-oxid szintnél éri el a maximumot. Ez a növekedés inkább a takarmányban lévő természetes króm nagyobb mértékű visszatartásával, mint a kiegészített króm-oxid felszívódásával függhet össze. Arról számoltak be (Evtushenko és mtsai., 1986), hogy a szövetekben felhalmozódott fémek szintje változatlanul egy platón maradt, még akkor is, ha az organizmusokat elég hosszú ideig folyamatosan kitették nekik.
Az ezekben a vizsgálatokban használt marker szintek (5-10% króm-oxid beépítve a táplálékba), még nagy tisztasági fok mellett is, a króm komplexképződés más formáit biztosíthatják, amelyek az emésztőrendszerben vagy más úton felszívódhatnak a halak által.