Sanes és Lichtman e Brainbow-konstrukciók egerekbe történő beültetéséhez pronukleáris injekciót használt. Amikor az egéragyakat leképezték, 3-4 színnél sokkal több színt találtak a konstrukció több példányának tandem integrációja miatt (kb. 8 a Brainbow-1.0 egerekben.) A többszörös, független rekombinációs események kombinatorikus hatása a színek szivárványához vezet. A konstrukció három kópiája esetén tíz színt várnánk (lásd a jobb oldali táblázatot); különböző jelentésekben Sanes és Lichtman 90-160 különböző színt figyelt meg a nagyobb kópiaszám miatt. A Brainbow elnevezés igazán találó erre a színes technológiára.
A rendszer optimalizálása: Brainbow-3
Bár a Brainbow biztosította az idegtudósok számára az egyes neuronok jelöléséhez szükséges színek széles skáláját, a rendszer számos korlátozástól is szenvedett. Először is, a Brainbow egérszövetek képalkotása kihívást jelentett az alacsony fluoreszcencia-intenzitás miatt, amelyet részben a fluorofór fotoinstabilitása okozott, valamint a fluorofóroknak a neuronok szomatájában való aggregálódási hajlama miatt. Másodszor, a rendszer nem tette lehetővé az immunfestéssel történő elemzést. Bár a felhasznált fluoroforok fluoreszcenciájukban különböznek egymástól, fehérjeszekvenciáik nagymértékben homológok, ami megakadályozza az egyes fluoroforokra specifikus antitestek tervezését. Harmadszor, a Brainbow-1 és Brainbow-2 mindegyike tartalmazott egy “alapértelmezett” állapotot; például a Brainbow-1.0 RFP-t expresszál, amikor a konstrukció nem ment át rekombináción. Ezt az alapértelmezett állapotot a neuronok többsége aránytalanul expresszálta, ami korlátozta az egy adott területen megfigyelhető különböző színek számát.
2013-ban Dawen Cai és munkatársai kiadták a Brainbow technológia továbbfejlesztését, a Brainbow-3.0-t, azzal a céllal, hogy a fent felsorolt korlátozásokat kiküszöböljék. Először is számos fluoreszcens fehérjét átvizsgáltak, hogy megtalálják azokat, amelyek ideális tulajdonságokkal rendelkeznek (alacsony aggregáció, magas fotostabilitás és nagy stabilitás a rögzítés után.) Az így kapott hét fehérje közül három olyan fehérjét választottak ki, amelyeknél mind a fluoreszcencia, mind a szekvencia átfedés mértéke alacsony (korall mOrange2, medúza EGFP és tengeri anemon mKate2.) Ezután sikeresen létrehoztak egyedi antitesteket mindegyik fehérjéhez, és megerősítették, hogy nincs keresztreaktivitás, ami megnyitotta az utat az immunfestési elemzés előtt. Az egyenletes sejtjelölés elérése érdekében a fluoreszcens fehérjék farnezilált származékait hozták létre, amelyek közvetlenül a sejtmembránokba áramlanak. A farnezilált származékok membránforgalma lehetővé teszi a Brainbow-1 és -2 segítségével korábban nem látható finom axonális és dendritikus folyamatok jelölését.
A Brainbow-1.0 általános szerkezete megmaradt a Brainbow-3.0-ban, de mOrange2, EGFP és mKate2 fluorofórokkal; az mOrange2 az alapértelmezett állapot. Ezzel szemben a Brainbow-3.1 és -3.2 nem mutat alapértelmezett fluoreszcenciát a közvetlenül a promóter után hozzáadott transzlációt blokkoló STOP kazetta miatt. A STOP kazetta egy mutáns YFP-t tartalmaz, amely nem fluoreszkál, de immunfestéssel kimutatható. Ez a tulajdonság megkönnyíti a Cre-negatív Brainbow egerek szűrését annak meghatározására, hogy hány és milyen típusú sejtben fejeződik ki a konstrukció. A Brainbow-3.2 fotostabilitása javult a woodchuck hepatitis vírus poszt-transzkripciós szabályozó elem (WPRE) hozzáadásának köszönhetően, amelyet általában a transzgén fehérje szintjének növelésére használnak.
Brainbow-változatok és alkalmazások az egéragyon túl
A Brainbow-rendszer továbbfejlesztése mellett Sanes és Lichtman egy kiegészítő Flpbow-konstrukciót is kifejlesztett, amely funkcionálisan hasonló a Cre-alapú Brainbow-hoz, de FLP/FRT rekombinázzal vezérelt. Különböző promóterek alá helyezve a Brainbow és az Flpbow különböző sejtpopulációk jelölésére használható.
A Brainbow transzgénnel és Cre-vel rendelkező állatok előállításához szükséges állattenyésztés csökkentése érdekében Cai és munkatársai létrehoztak egy Autobow konstrukciót is, amely Cre-t és XFP-t is tartalmaz. A Cre termelés hajtja a rekombinációt és az XFP szelekciót, majd a Cre önkivágást. Ezek a konstrukciók legalább hat generáción keresztül stabilan fennmaradnak.
A neuronális pThy1-Brainbow konstrukciókon kívül az Addgene két Brainbow adeno-asszociált vírusvektort (AAV) is kínál: AAV-EF1a-BbChT és AAV-EF1a-BbTagBY. Ezek a konstrukciók az AAV-hoz kapcsolódó méretkorlátozások miatt egyenként két XFP-t tartalmaznak; mindkét konstrukcióval történő együttes fertőzés legalább 8 színt eredményez. Az AAV használata térbeli és időbeli ellenőrzést biztosít csíravonal-módosítás nélkül, és lehetővé teszi a Brainbow használatát számos fajnál.
Még több változatot hoztak létre más laboratóriumok, köztük a Hugo J. Snippert, et al. (2010) által leírt R26R-Confetti és a Karine Loulier, et al. (2014) által leírt MAGIC Marker stratégiát.
A Brainbow technikákat jelenleg olyan modellorganizmusok vizsgálatára is alkalmazzák, mint a Drosophila és a zebrafish. A Brainbow Drosophilában segített az idegi áramkörök, például a motoros neuronok és a neuromuszkuláris csomópont közötti kapcsolatok feltérképezésében. A zebrahalakban a módszer nagyon hasznosnak bizonyult a vonalkövetésben; a “Zebrabow”-t a szaruhártya-hám fejlődésének nyomon követésére használták.
A neurológia és a fejlődés iránt érdeklődő tudósok számára a Brainbow értékes eszköz az egyes sejtek jelölésére és követésére a színek széles skálája és nagy stabilitása miatt. Sanes és Lichtman becslése szerint a Brainbow színes jelölése legalább egy nagyságrenddel csökkentette az agy adott szakaszának feltérképezési idejét. Nyilvánvaló, hogy a Brainbow technika további finomításai fontos betekintést nyújtanak majd az agy és más biológiai rendszerek bonyolult fizikai szerveződésébe.
Érdekli a Brainbow alkalmazása a kutatásában? Nézze meg az Addgene-nél elérhető Brainbow plazmidokat!
Brainbow plazmidok keresése @Addgene:
- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plazmidok
- Brainbow 3.0, 3.1, 3.2 plazmidok
Transzgenikus stratégiák fluoreszcens fehérjék kombinatorikus kifejezésére az idegrendszerben. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
A connectom technicolour megközelítése. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
A bélkripta homeosztázisa a szimmetrikusan osztódó Lgr5 őssejtek közötti semleges versengés eredménye. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: rekombináz alapú fluoreszcens jelölési technika az idegi expressziós mintázatok felosztására. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Febr. 6. PubMed.
Flybow: genetikai multicolor sejtjelölés neurális áramkörök elemzéséhez Drosophila melanogasterben. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Febr. 6. PubMed.
Improved tools for the Brainbow toolbox. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: multispektrális sejtjelölés sejtkövetéshez és vonalelemzéshez zebrahalakban. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex sejt- és vonalkövetés kombinatorikus címkékkel. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
oldalon.