Abstract
Danggui Buxue Tang (DBT), egy Astragali Radix (AR) és Angelicae Sinensis Radix (ASR) tartalmú gyógynövény főzet, amelyet Kínában már több mint 800 éve használnak a nők menopauzaszerűségének kezelésére. A farmakológiai eredmények azt mutatták, hogy a DBT jelentős ösztrogén tulajdonságokat mutatott in vitro, ami ezért arra utalt, hogy a DBT aktiválhatja a nukleáris ösztrogénreceptorokat. Itt a DBT ösztrogén tulajdonságait vizsgáltuk egy ovariektomizált in vivo patkánymodellben: A DBT-t 3 napig alkalmaztuk az ovariektomizált patkányokon. A DBT alkalmazása nem változtatta meg a méh és a máj tömegét, valamint a proliferációs markerek, köztük az α és β ösztrogénreceptorok transzkripciós expresszióját. A DBT azonban serkentette az ösztrogénre reagáló gének transzkripciós expresszióját. Ezenkívül megerősítést nyert a DBT induktív szerepe az arilhidrogén-receptor család tagjainak expressziójára az ovariektomizált patkányok méhében és májában. A DBT ezen válaszai azonban egyértelműen különböztek a 17β-ösztradiol esetében itt kimutatható válaszmintázattól. A DBT tehát gyenge, de jelentős ösztrogén tulajdonságokat mutatott in vivo; egyes aktivitásai azonban függetlenek voltak az ösztrogénreceptortól. Így a DBT egy izgalmas kínai gyógynövény főzet lehet a menopauzában lévő nők hormonpótló terápiájának alternatív kezelésére, utólagos ösztrogén mellékhatások nélkül.
1. Bevezetés
A hagyományos kínai gyógyszereket (TCM) Kínában több mint ezer éve használják gyógyszerként vagy egészségügyi táplálékkiegészítőként. Történelmileg a TCM-eket főzetként készítik egyedi módszertannal, különböző gyógynövények speciális kombinációival, mint képletet. A több ezer gyógynövényképlet közül a Danggui Buxue Tang (DBT) egy egyszerű gyógynövény főzet, amely két gyógynövényből áll. A DBT-t először a Neiwaishang Bianhuo Lun-ban írta le Li Dongyuan Kínában, Kr. u. 1247-ben. Li leírta, hogy a DBT receptjének 10 qian Astragali Radix (AR), az Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge vagy Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungevar. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao gyökere, és két qian Angelicae Sinensis Radix (ASR), az Angelica sinensis (Oliv.) Diels gyökere kell tartalmaznia. Egy qian körülbelül 3 grammnak felel meg. A DBT-t Kínában a nők számára a klimaxos tünetek gyógymódjaként írják fel, amely a “Qi” (életenergia) növelésével és a “vér” (testkeringés) táplálásával javítja az egészségüket.
A klimaxban lévő nők hőhullámoktól, izzadástól, szorongástól és hangulatingadozástól szenvednek, valamint számos egészségügyi probléma, például a csontsűrűség tömegének csökkenése (csontritkulás) és a szív- és érrendszeri betegségek fokozott kockázatától. Ezek a problémák nagyrészt a petefészekhormonok, különösen az ösztrogének hiányára vezethetők vissza. A hormonpótló terápiát (HRT) sok éven át alkalmazták a menopauzális tünetek enyhítésére, de ez a kezelés mellékhatásokkal járt, azaz a mellrák, a szívroham és a stroke fokozott kockázatával . Tekintettel ezekre a klinikai kockázatokra, kiterjedt erőfeszítéseket fordítottak olyan új gyógyszerek keresésére vagy kifejlesztésére, amelyek a hormonterápia előnyeit nyújtanák, de minimális kockázattal . A több ezer gyógynövényt tartalmazó TCM olyan ígéretes forrás, amely tökéletes megoldást nyújthat . Valóban, néhány gyógynövénykészítmény kifejezett hatékonyságot mutatott a menopauzális tünetekre, és ennek következtében a nők széles körben használták a menopauzális tüneteik enyhítésére, például a DBT-t . Az emlőmirigyből és csontból származó sejtekkel végzett in vitro kísérletek azt sugallták, hogy a DBT hatékonyságának legalább egy része ösztrogénreceptor- (ER-) függő mechanizmusokon keresztül közvetít. E megfigyelések in vivo alátámasztása érdekében a DBT-t ovariektomizált Wistar patkány modellben vizsgálták a potenciális ösztrogén tulajdonságok szempontjából. Mivel a DBT egy főzet, amelyet hagyományosan teaként fogyasztanak, az állatoknak a DBT-t az ivóvízen keresztül adták. Ezt a megközelítést alkalmazva háromnapos uterotrófiás vizsgálatot végeztünk a DBT molekuláris hatásmechanizmusainak – beleértve a szervi súlyokat és a génexpresszió szabályozását – tisztázásához való hozzájárulás szempontjából releváns válaszok feltárására.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok és módszerek
2.1. A DBT molekuláris hatásmechanizmusainak feltárása. Növényi anyagok és DBT előállítása
Az A. membranaceus var. mongholicus gyökeréből származó hároméves AR-t Shanxi tartományból , az A. sinensis 2 éves ASR-jét pedig a Gansu tartománybeli Minxianból gyűjtöttük. Ezeket a növényi anyagokat a terepi gyűjtés során Dr. Tina Dong morfológiailag hitelesítette. A megfelelő utalványokat egész növények formájában, a 02-9-1 számú utalványt az ASR-re és a 02-10-4 számú utalványt az AR-re, a Hongkongi Tudományos és Technológiai Egyetem Kínai Orvostudományi Központjában helyezték letétbe. A 17β-ösztradiolt (E2) a Sigma-Aldrich-tól (Deisenhofen, Németország) szereztük be. 250 g felszeletelt AR-t és 50 g felszeletelt ASR-t összekevertek (az arány 5 : 1), majd 2400 ml (w : v = 1 : 8) vízben 2 órán át főzték, majd a főzetet leszűrték. A maradékot 1800 ml (w : v = 1 : 6) vízben 1 órán át forraljuk. Az egyesített kivonatokat vákuumban szárítottuk és -20 °C-on tároltuk. Ez a kivonás, az ősi előkészítést követően, a legjobb kivonási feltételnek bizonyult . A DBT kémiai tulajdonságainak standardizálására két kémiai markert használtunk az AR-ban (kalikozin és formononetin) és két másikat az ASR-ben (ferulasav és ligusztilid). A standardizált DBT-nek legalább 0,186 mg kalikozint, 0,155 mg formononetint, 0,351 mg ferulasavat és 0,204 mg ligusztilidot kell tartalmaznia a DBT egy gramm szárított tömegére vetítve, amint arról korábban beszámoltunk .
2.2 . Állatok
Fiatal nőstény Wistar patkányokat ( g) a Harlan Winkelmanntól (Borchen, Németország) szereztük be, és ellenőrzött hőmérsékleti (20°C ± 1, relatív páratartalom 50-80%) és megvilágítási (12 óra fény, 12 óra sötét) körülmények között tartottuk. Minden patkány szabadon hozzáférhetett a standard patkánytáphoz (SSniff R10-Diet, SSniff GmbH, Soest, Németország) és vízhez. Minden állattartási és kezelési körülmény megfelel a németországi Intézményi Állatgondozási és Állatfelhasználási Bizottság irányelveinek.
2.3. Uterotrófiás vizsgálat
Az ösztrogénhatást az OECD 440-es irányelve szerint 3 napos vizsgálatban vizsgálták ovariektomizált patkányokon. A kísérleti eljárásokat az 1. ábra vázlatosan összefoglalja. Röviden, az ovariektómiát és 14 napos endogén hormonális csökkenést követően az állatokat 3 napig kezelték. Az állatokat véletlenszerűen osztották be a növényi kivonatokkal, a pozitív kontrollal vagy a hordozóanyaggal végzett kezelésbe (). A DBT-t szájon át adtuk 0,01 g/kg BW/d vagy 1 g/kg BW/d BW és E2 (1 μg/kg BW/d; szubkután injekció) dózisban, amely pozitív kontrollként szolgált. Az állatokat CO2-inhalációval végzett könnyű érzéstelenítést követően dekapitációval áldozták fel. Meghatároztuk a méh és a máj nedves tömegét. Az anyaméhet és a májat folyékony nitrogénben fagyasztottuk le az RNS előállításához.
Kísérleti terv. Az ábra összefoglalja a vizsgálat kísérleti elrendezését. Sematikusan mutatja a munkafolyamatot, valamint a bevont kezelési csoportok összefoglalóját. bw: testtömeg; DBT: Danggui Buxue Tang; DBT01 és DBT1: DBT 0,01 és 1 g/kg testsúly/d.
2.4. Teljes RNS előállítása és reverz transzkripció
A teljes citoplazmatikus RNS-t a patkány méhből a standard TRIzol módszerrel (Invitrogen, Grand Island, NY) extraháltuk. A DNS-maradványokat enzimatikusan eltávolítottuk emésztéssel (Deoxyribonuclease I, Ambion, Foster City, CA), és az eltávolítást PCR-rel ellenőriztük. Az első szálú cDNS szintézishez Superscript II reverz transzkriptázt (Invitrogen) és Oligo (dT) 12-18-t használtunk.
2.5. Az első szálú cDNS szintézishez az Oligo (dT) 12-18-t használtuk. Kvantitatív valós idejű PCR
A kvantitatív valós idejű PCR-t Platinum Taq DNS-polimerázzal (Invitrogen) végeztük az iQ valós idejű detektáló rendszerrel ellátott iCycler hőcikleren. A reakciókat háromszor három példányban futtattuk le. Vortexelés után a keverékből 50 μL aliquotát pipettáztunk a 96 lyukú vékonyfalú PCR-lemez (Bio-Rad, Hercules, CA) minden egyes mélyedésébe. A PCR-reakciók egy első denaturáló ciklusból álltak 95°C-on 3 percig, majd 50 ciklusból: 10 s 95°C-on, 15 s 60°C-on és 30 s 72°C-on. A fluoreszcenciát a 60°C-os lágyítási lépés végén számszerűsítettük, és a termék azonosságát olvadási görbeelemzéssel (60-95°C) igazoltuk. A primer szekvenciákat és az amplikonok méretét a Supplementary Material (Kiegészítő anyagok) 1. kiegészítő táblázata foglalja össze, amely online elérhető a http://dx.doi.org/10.1155/2014/438531 oldalon. A célgének relatív mRNS-mennyiségét egy endogén referencia génhez (citokróm C oxidáz alegység 1, COX1) való normalizálás után számoltuk ki. Az eredményeket az mRNS relatív mennyiségeként fejeztük ki a hordozóanyag-kontroll állatokhoz viszonyítva a .
2,6 képlet segítségével. Statisztikai elemzés
A jelen munka adatainak statisztikai elemzését kétirányú varianciaanalízissel végeztük, amelyet a kiválasztott átlagok páronkénti összehasonlítása követett a Student-teszt segítségével. A szignifikancia kritériumát , , , és a kontrollhoz viszonyítva határoztuk meg.
3. Eredmények
3.1. Az eredmények
. Testtömeg és szervnedves súlyok
Az ovariektomizált patkányok uterotrófiás válaszát a gyógyszeres kezelés 3 napja után mértük. A DBT-t két dózisban alkalmaztuk: 0,01 (DBT0,01) és 1 (DBT1) g/kg BW/d. Pozitív kontrollként E2-t használtunk 1 μg/kg BW/d mennyiségben, negatív kontrollként pedig a hordozó ricinusolajat. Ezek a kezelések nem tudták befolyásolni az állatok testtömegét (2. ábra a)). Ami a nedves tömegeket illeti, a 3 napig tartó E2-kezelés a méh nedves tömegének több mint ötszörösére történő jelentős növekedését okozta, de nem befolyásolta a máj tömegét (2. ábra (b)). A DBT-vel való kezelés, mind a DBT0,01, mind a DBT1 koncentráció esetében, nem volt hatással a méh és a máj tömegére (2. ábra b)). Ez a megfigyelés összhangban volt a Ki-67 mRNS-ének, egy érzékeny proliferációs markernek a méhben történő expressziójával, amely azonban nem változott a DBT-kezelést követően (2. ábra (c)). A Ki-67 mRNS expressziója az E2 kezelés hatására erősen serkentődött (2. ábra (c)). A májban egyik kezelés sem eredményezett statisztikailag szignifikáns hatást a Ki-67 expressziójára (2(c) ábra).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
E2 vagy DBT hatása az állatok test- és szervsúlyára. (a) Az ovariektomizált állatokat három napon keresztül E2-vel (1 μg/kg BW/d; szubkután) vagy DBT-vel (0,01 g/kg/d BW és 1 g/kg/d BW, szájon át) kezelték; a kezeletlen ovariektomizált állatok kontrollcsoportként (Ctrl.) szolgáltak. Meghatároztuk a patkányok testtömegét az áldozás előtt. A nedves szerveket, beleértve a méhet és a májat is, megmértük. (c) A Ki-67 proliferációs marker mRNS-expressziójának szabályozását az uterekben és a májban félkvantitatív valós idejű PCR-analízissel elemeztük. A csillagok a megfelelő kontrolloktól szignifikánsan eltérő értékeket jelzik. , , és .
3.2. Az ösztrogén-asszociált gének expressziója az anyaméhben és a májban
A patkány méhben az ERα és ERβ mRNS-expresszióját mutatták ki minden kezelési körülmények között. Az E2-kezelés után az ERα és ERβ mRNS-ek a kontroll állatokhoz képest a várt szignifikáns downregulációt mutatták, míg a DBT alkalmazása nem tudta befolyásolni az ERα és ERβ mRNS-expresszióját (3. ábra (a)). Az ER méhbeli hatására vonatkozóan ismert néhány nagyon érzékeny markergén, amelyek az ösztrogénválaszok monitorozására szolgálnak, ezek a komplement C3 (C3), a kalciumkötő fehérje 9 kDa (CaBP9k) és a klaszterin (Clu). A méhben az E2-kezelés a C3-at és a CaBP9k-t kódoló mRNS több százszoros szignifikáns upregulációját eredményezte, amit a Clu mRNS expressziójának jelentős downregulációja kísért (3. ábra (b)). Úgy tűnik, hogy a DBT képes volt az ER-függő C3 és CaBP9k szabályozott gének nagyon enyhe (az 5-szeres mértéket nem meghaladó) upregulációját kiváltani. A DBT nagyobb dózisa a Clu mRNS expressziójának downregulációját okozta, amely az átlagérték magas szórása miatt nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (3. ábra (b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Az ösztrogénreceptorok és az ösztrogénválasz gének expressziójának szabályozása az uterusban. (a) Az ERα és ERβ mRNS expresszióját az uterekben és (b) az ösztrogénválasz gének, köztük a C3, CaBP9k és Clu mRNS expresszióját kvantitatív valós idejű PCR analízissel elemeztük. A csillagok a megfelelő kontrolloktól szignifikánsan eltérő értékeket jelzik. , , és .
Az ERα mRNS-expresszióját minden kezelési körülmények között kimutatták a patkánymájban. Az ERα E2 általi downregulációjának autoregulációs válasza nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét, míg mindkét DBT-koncentráció statisztikailag szignifikáns módon szabályozta le az ERα stabil állapotú mRNS-szintjét (4. ábra a)). Az ERα-függő válaszgének májban történő expressziójának értékeléséhez meghatároztuk a megfelelő májspecifikus ER-válaszgének, azaz a CaBP9k és az inzulinszerű növekedési faktor kötőfehérje I (IGFBP1) expressziós szintjét. Az E2-kezelés hatására a CaBP9k mRNS expressziója felfelé, az 1GFBP1 mRNS expressziója pedig lefelé szabályozódott a májban (4. ábra (b)). A nagy dózisú DBT-vel (DBT1) végzett kezelés jelentősen csökkentette az IGFBP1 expresszióját. A CaB9k fokozott expressziója mutatkozott a DBT-kezelést követően mindkét koncentrációban, de a szórás miatt mindkét esetben nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (4. ábra (b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Az ösztrogénreceptorok és az ösztrogénválasz gének expressziójának szabályozása a májban. Az ERα mRNS expresszióját a májban (a) és az ösztrogénválasz gének, köztük a CaBP9k és az IGFBP1 mRNS expresszióját a májban (b) kvantitatív valós idejű PCR analízissel elemeztük. A csillagok a megfelelő kontrolloktól szignifikánsan eltérő értékeket jelzik. , , és .
3.3. A lipidanyagcseréhez kapcsolódó gének expressziója a májban
Mivel a DBT feltehetően növeli a “Qi”-t, megvizsgáltuk a lipidanyagcseréhez kapcsolódó gének expresszióját. Mivel a máj a lipidanyagcsere fő helyszíne, a máj működése összefügg az elhízással, ami viszont a hormonfüggő szervek betegségeinek, például a mellráknak a kockázati tényezője. Ezért vizsgáltuk a HDL-koleszterin fő komponensének számító Apolipoprotein A-I (Apo-A1) és a peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptorok (PPAR) expresszióját, amelyek lipidszenzorokat képviselnek, és különböző módon részt vesznek az energiaanyagcsere szabályozásában. A PPARα DBT általi upregulációja nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét. Ami a PPARγ-t illeti, a DBT 1 g/kg BW/d koncentrációban lefelé szabályozta az mRNS expresszióját (5. ábra a)). Ez a downreguláció hasonló volt az E2 által kiváltotthoz. Ezzel szemben a DBT potenciális ösztrogén tulajdonságaitól egyértelműen független hatás volt a PPARδ mRNS expressziójának mindkét DBT-dózis általi kifejezett downregulációja (5. ábra (a)). Ezek az eredmények egyértelműen arra utalnak, hogy a DBT a PPAR-család receptorainak expressziójának modulációján keresztül szabályozhatja a zsírból származó energia elérhetőségének és fogyasztásának szabályozásában szorosan részt vevő receptorok expresszióját. A metabolikus szindróma szövődményeinek lehetséges kapcsolataként a koleszterin-anyagcsere szabályozása érdekes. Ezért megvizsgáltuk az Apo-A1 mRNS expressziójának szabályozását. Az expressziós mintázat a DBT ösztrogénszerű tulajdonságára utal 1 g/kg BW/d koncentrációban, amely az E2-hez hasonlóan lefelé szabályozta az Apo-A1 mRNS expresszióját.
(a)
(b)
(a)
(b)
A peroxiszóma-proliferátor-gén expressziója.aktivált receptorok és az Apo-A1 expressziója a májban. (a) A PPARα, PPARγ és PPARδ mRNS-expresszióját a májakban kvantitatív valós idejű PCR-analízissel elemeztük. (b) Az Apo-A1 mRNS-expresszióját májakban kvantitatív valós idejű PCR-elemzéssel elemeztük. A csillagok a megfelelő kontrolloktól szignifikánsan eltérő értékeket jelzik. , , és .
3,4. A DBT szabályozása az aril-szénhidrogén receptor útvonalon a méhben és a májban
A hatékony méregtelenítés az egészség szempontjából is kulcsfontosságú. Az aril-szénhidrogén receptor (AHR) ismert arról, hogy a májban és más szövetekben metabolizáló/detoxifikáló enzimek expresszióját váltja ki, amely az Nrf2-szabályozott enzimek akkumulátorával összehangoltan működik. Itt vizsgáltuk az AhR, az AhR családtagok és az AhR-reagáló gének expresszióját a méhben és a májban DBT hatására az E2-hez képest. Összességében az AhR, az AhR családtagok és a válaszgének expressziójának szövetspecifikus szabályozását észleltük a DBT-kezelést követően.
A méhben az AhR mRNS expressziója erősen lecsökkent az E2 hatására, míg a DBT hatására nem volt látható változás (6. ábra (a)). Az AHR társszabályozójának, az arilhidrogénreceptor nukleáris transzlokátor 1 (ARNT 1) mRNS-ének expresszióját az E2 lefelé szabályozta, míg a DBT nagy dózisban az ARNT1 mRNS-szintjének upregulációjához vezetett ebben a szervben. Ami az ARNT2-t illeti, az E2-kezelés hatására a méhben az mRNS-expresszió erős downregulációja következett be, amely hatás nem volt kimutatható a DBT hatására (6. ábra (b)). A citokróm P450 (1. család) A1 (Cyp1A1) és a glutation-S-transzferázok Ya (GST-Ya) az AhR működésére nagyon érzékeny válaszgéneknek tekinthetők. A Cyp1A1 mRNS-szintjét a méhben az E2 erősen lefelé szabályozta, és ez a hatás a DBT mindkét dózisára adott válaszként is kimutatható volt, de kisebb mértékben (6. ábra (c)). A GST-Ya mRNS-expresszióját csak az E2 hatására találtuk felfelé szabályozottnak. A DBT-kezelés mindkét dózisban nem befolyásolta a GST-Ya mRNS expresszióját a méhben (6. ábra (c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Az AhR- expressziójának szabályozásavonatkozású gének aktiválódása a méhben. (a) Az AhR mRNS-expresszióját az uterekben, (b) az ARNT1 és ARNT2 mRNS-expresszióját az uterekben, valamint (c) a Cyp1A1 és GST-Ya mRNS-expresszióját az uterekben félkvantitatív valós idejű PCR-analízissel elemeztük. A csillagok a megfelelő kontrolloktól szignifikánsan eltérő értékeket jelzik. , , és .
A májban az AhR mRNS enyhe, statisztikailag nem szignifikáns upregulációja volt kimutatható az E2-kezelés hatására, míg a DBT erősen, több mint 3-szorosára indukálta az AhR mRNS expresszióját (7. ábra (a)). Az ARNT1 mRNS-szintjét csak a DBT alacsony dózisa tudta indukálni, az E2 és a DBT magas dózisa nem. Továbbá úgy tűnt, hogy mindhárom kezelés felfelé szabályozza az ARNT2 mRNS expresszióját; azonban egyik érték sem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (7. ábra (b)). Az E2 kezelés a Cyp1A1 mRNS szintjének enyhe, de nem szignifikáns felszabályozását eredményezte, míg a DBT dózisfüggő módon szabályozza le a Cyp1A1 mRNS expresszióját. Ezzel szemben az E2-kezelés nem eredményezte a GST-Ya mRNS-expressziójának megváltozását, míg a DBT nagy dózisban statisztikailag szignifikáns, dózisfüggő módon szabályozta le a GST-Ya mRNS-expresszióját (7. ábra (c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Az AhR- expressziójának szabályozásavonatkozású gének májban. (a) Az AhR mRNS expresszióját a májban, (b) az ARNT1 és ARNT2 mRNS expresszióját a májban, valamint (c) a Cyp1A1 és GST-Ya mRNS expresszióját a májban félkvantitatív valós idejű PCR analízissel elemeztük. A csillagok a megfelelő kontrolloktól szignifikánsan eltérő értékeket jelzik. , , és .
4. Megbeszélés
Noha a DBT in vitro potenciális ösztrogénhatást mutatott, a DBT in vivo potenciális hormonális tevékenységéről korlátozottak az információk. Jól ismert, hogy az endometriumsejtek proliferációja az ösztrogének ellenőrzése alatt áll, és hogy az endometrium karcinóma kockázata az ösztrogénpótló terápia hatására nő . Ezen túlmenően, mivel az ösztrogénszerű aktivitással rendelkező természetes vegyületek gyakran szervszelektív tulajdonságokat mutatnak in vivo, értékeltük a szervfüggő módon végzett uterotrófiás kísérletet. Értékeltük a DBT lehetséges hatásait a méhben, mint az ösztrogénhatás klasszikus célszervét jelentő reproduktív traktus szervében, és a májban, mint az ERα-t túlnyomórészt expresszáló szervek egyikében lévő fő metabolikus helyen. Ezért a DBT endogén ösztrogén hiányában kifejtett hatásának vizsgálatához petefészek-eltávolított nőstény patkányokat használtunk, hogy értékeljük a DBT ER-szelektivitását a méhben és a májban.
Az eredmények azt mutatták, hogy a DBT egyik vizsgált dózisban sem változtatta meg a méh és a máj nedves tömegét, illetve a proliferációs markerek és az ER-ek expressziós szintjét. Az ER hatására a méhben néhány nagyon érzékeny markergén ismert, amelyek felveszik az ösztrogénválaszt, vagyis a C3 és a CaBP9k upregulációja és a Clu downregulációja. A C3 és a CaBP9k az E2 hatására felfelé szabályozódhatott, míg a Clu az E2-kezelés hatására a méhben lefelé szabályozódott. A DBT nagyon enyhén utánozta az ösztrogénválaszt a C3 és a CaBP9k esetében, de a Clu esetében nem. Ez azért érdekes, mert a C3 és a CaBP9k felszabályozása ERE-válaszelemeket foglal magában, míg a Clu ER által közvetített downregulációjának pontos mechanizmusa nem ismert. A Clu promóterében található transzkripciós faktor kötőhelyeket tükrözve azonban valószínűsíthető az SP1- és AP-mediált folyamatok részvétele . Ezzel párhuzamosan a CaBP9k és az IGFBP1 expressziójának májbeli változásait ösztrogénválasz-markerekként állapították meg, bár az általános válasz messze alacsonyabb volt, mint a CaBP9k vagy a C3 esetében a méhben kimutatható. A májban a DBT ismét gyenge ösztrogén tulajdonságokat fejtett ki a 3 napos uterotrófiás vizsgálatban. A hatások csak az ösztrogénhatás legérzékenyebb génexpressziós markereivel voltak kimutathatók.
A máj ráadásul a lipidanyagcsere egyik fő helyszíne, amely összefügg az elhízással, ami viszont a hormonfüggő szervek, például az emlőrák megbetegedéseinek kockázati tényezője. Ezért vizsgáltuk az Apo-A1 mint a HDL-koleszterin fő összetevőjének és a PPAR-receptoroknak az expresszióját, amelyek különböző módon vesznek részt az energiaanyagcsere szabályozásában. Ezek a természetes vegyületek ismert célpontjai is, és a hozzájuk való kötődés javítja például a glükózfelvételt . Eredményeink egyértelműen arra utalnak, hogy a DBT a PPAR család receptorainak expressziójának modulációján keresztül hozzájárulhat a zsírból származó energia elérhetőségének és felhasználásának szabályozásához. Számos áttekintés foglalja össze a metabolikus útvonalak szabályozását a PPAR-ok aktiválását követően , amely téma jelen dolgozat fókuszán kívül esik. A PPAR-ral kapcsolatos eredményeink két jellemzője azonban vitát érdemel. A PPARδ erős downregulációját figyeltük meg a DBT hatására. Ezzel kapcsolatban fontos megemlíteni, hogy a PPARδ nyilvánvalóan ösztrogén/ER független módon reagált a DBT-kezelésre. A PPARδ expresszió DBT általi downregulációjának funkcionális következményeit ezen a ponton nyitva kell hagyni; ez azonban nem a PPARδ autoregulációs downregulációjának köszönhető a DBT összetevőinek megkötését követően, mivel a DBT nem stimulálta sem a PPARδ, sem a PPARγ-függő riportergének aktiválódását tranziens transzfekciós próbában (az adatok nem láthatóak). A PPARδ-függő jelátviteli kaszkád DBT általi aktiválása azonban érdekes lenne, mivel a PPARδ a zsír mobilizációjának és a zsírból történő energiafelhasználásnak a fő szabályozója, és mivel ez a fenotípus potenciálisan az elhízáshoz és annak megelőzéséhez kapcsolódik.
A PPARγ ezzel szemben legalábbis a DBT nagy dózisában ösztrogénszerű módon reagált a downregulációval. A PPARγ inzulinérzékenyítő tulajdonsága mellett fontos jellemzője, hogy meghatározza a mesenchymális őssejtek őssejt-sorsát. A PPARγ szkeletális hatásai időközben jól ismertek. Aktiválja az adipogén differenciálódást, ezáltal gátolja az oszteogén differenciálódást . Ez a helyzet a menopauzában lévő nők számára hátrányos lenne, ezért a PPARγ DBT általi downregulációja kedvező hatásra utalhat.
Hosszú ideje ismert, hogy az AhR útvonal a májban és más szövetekben metabolizáló enzimek expresszióját váltja ki, többnyire az Nrf2 szabályozott enzimek akkumulátorával összehangoltan , ezáltal hozzájárulva a méregtelenítési folyamathoz. Nemrégiben kimutattuk, hogy kapcsolat áll fenn az ösztrogén funkció és az AhR szabályozása, valamint az AhR jelátviteli kaszkád tagjai között a méhben . Ezért összehasonlítóan megvizsgáltuk az AhR, az AhR család tagjai és az AhR válaszgének expressziójának szabályozását a méhben és a májban a DBT által az ösztradiolhoz képest. Először is megerősítettük az AhR gének tagjainak ösztrogén válaszmintázatát . A DBT-kezelés esetében összességében kimutattuk az AhR, az AhR családtagok és a válaszgének expressziójának szövetspecifikus szabályozását a DBT-kezelést követően. A Cyp1A1 és a GST-Ya, amellett, hogy az első (Cyp1A1) és a második lépés (GST-Ya) metabolikus enzimek tagjai, nagyon érzékeny válaszgéneknek tekinthetők az AhR és az ER útvonalakat érintő crosstalk mechanizmusok tekintetében, és itt is teszteltük őket. Érdekes megfigyelésként a DBT-kezelés a Cyp1A1 expressziójának szabályozásában ösztrogénszerű válaszmintázatot mutatott, a GST-Ya esetében azonban nem, ami arra utal, hogy a DBT májbeli működése ösztrogénszerű és ösztrogénfüggetlen tulajdonságokkal is jár. Ugyanez vonatkozik feltehetően az AhR által kiváltott válaszokra is. A jövőre nézve érdekes lesz látni, hogy a DBT és/vagy alkotórészei kiváltják-e az AhR által közvetített riportergének aktivitását.
Mellett, bár gyengén, de azt találtuk, hogy az ARNT molekulákat a DBT a májban felszabályozza. Ez azért érdekes, mert az ebben a tanulmányban részt vevő szerzők közül néhányan nemrégiben leírták a HIF1α DBT általi felszabályozását, ami végül az eritropoetin felszabályozásához vezet . Az ARNT1-et HIF1β-nek is nevezik, és a HIF1α heterodimer dimerizációs partnerét képviseli a nukleáris válaszok közvetítésében . Más szóval, itt megmutattuk, hogy a DBT nemcsak a HIF1α-t, hanem a HIF1β/ARNT1-et is felszabályozza, ezáltal potenciálisan támogatva a HIF1α erythropoiesisre gyakorolt hatását.
Összefoglalva, először mutattuk ki, hogy a DBT szabályozza az AhR jelátviteli kaszkád tagjainak mRNS szintjét, ezáltal ösztrogénszerű és ösztrogénreceptor független tevékenységet mutat, ami feltehetően a méregtelenítési mechanizmusok eltérő mintázatához vezet. Az utolsó fontos eredmény az volt, hogy a DBT hatásai szervszelektívnek tűnnek, és befolyásolják a menopauza egészségét érintő funkciókat. Ami a biztonságot illeti, nem volt jele a proliferáció ösztrogénfüggő serkentésének a reproduktív traktus szerveiben. Ami a hatékonyságot illeti, a DBT gyenge ösztrogén tulajdonságokat mutat, és szabályozza a funkcionálisan összekapcsolt lipidszenzorok expresszióját, amelyek többek között a PPAR és AhR molekulacsaládokat foglalják magukban, ez utóbbi kapcsolatot teremt a méregtelenítéssel és az energiaanyagcserével. Feltételezésünk szerint a DBT ezért olyan tulajdonságokkal rendelkezhet, amelyek közvetlenül és közvetve hatással vannak a menopauza egészségére.
Rövidítések
| TCM: | Tradicionális kínai orvoslás |
| DBT: | Danggui Buxue Tang |
| ASR: | Angelicae Sinensis Radix |
| AR: | Astragali Radix |
| AhR: | Aryl szénhidrogén receptor |
| Apo-A1: | Apolipoprotein A-1 |
| E2: | 17β-ösztradiol |
| ER: | Estrogén receptor |
| ERE: | Estrogen response element |
| HRT: | Hormonpótló terápia |
| PPAR: | Peroxisome proliferator-activated receptor. |
Érdekütközések összeférhetetlensége
A szerzők kijelentik, hogy e cikk publikálásával kapcsolatban nem áll fenn érdekellentét.
Köszönet
Ezt a kutatást a Research Grants Council of Hong Kong (HKUST 6419/06 M és N_HKUST629/07, 662608), a Croucher Foundation (CAS-CF07/08.SC03) Karl W. K. Tsim, valamint a German Research Foundation (DFG Vo410/6-5) és a German Academic Exchange Service (DAAD 50023165) Günter Vollmer számára nyújtott támogatásával végezték. A TU-Dresden munkatársai köszönik a Német Kutatási Alapítvány és a TU-Dresden nyílt hozzáférésű publikációs alapjának támogatását.
Kiegészítő anyagok
A génexpressziós elemzést a méh és a máj szövetmintákból származó RNS-készítményeken végeztük. Az elemzett génekre, a felhasznált primer szekvenciákra, valamint az amplikonok méretére vonatkozó információkat az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.
- Kiegészítő anyagok
.