Nincs CAP1-reguláció, de emelkedett S308/S310 foszforiláció, detektáltak hasnyálmirigyrák sejtekben
A CAP1 fehérjeszintjét Western blottinggal határozták meg a gyakran használt hasnyálmirigyrák sejtvonalak {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 és Mia PaCa-229} egy paneljében, és összehasonlították a kontrollként szolgáló immortalizált, de nem transzformált hTERT-HPNE30 hasnyálmirigy sejtvonalban. Amint az 1A. ábrán látható, mind a négy rákos sejtvonal bőséges CAP1-szintet expresszál, ami összehasonlítható a HeLa sejtekével, amelyekről korábban már beszámoltunk, hogy mind a CAP1, mind a CAP212 bőséges szintjét expresszálják. Megállapítottuk, hogy a nem transzformált hTERT-HPNE sejtek a CAP1 hasonló szintjét fejezik ki, mint a rákos sejtvonalak. Megvizsgáltuk a másik CAP izoforma, a CAP2 expressziós szintjét is, és azt találtuk, hogy a PANC-1 és a Mia PaCa-2 sejtek CAP2 expressziója jelentősen feljebb szabályozott, mint a hTERT-HPNE sejteké (1A. ábra).
A CAP1-en emelkedett S308/S310 foszforilációt, de nem szabályozott CAP1-expressziót észleltünk a hasnyálmirigyrákos sejtekben. (A) Western blot kimutatja, hogy a CAP1 bőséges, a HeLa sejtekhez hasonló expressziós szintje mind a négy rákos sejtvonalban kimutatható volt, és a kontroll hasnyálmirigy sejtek (hTERT-HPNE) hasonló CAP1 expressziós szintet mutattak. A CAP2 blot eredményei azt mutatják, hogy a PANC-1 és a Mia PaCa-2 ráksejtek bőséges CAP2 szintet expresszálnak, amely feltűnően magasabb volt, mint a kontroll hTERT-HPNE sejtekben. (B) A Western blot a CAP1 emelkedett S308/S310 foszforilációját mutatja a PANC-1 és CFPAC-1 hasnyálmirigyrák sejtekben a nem transzformált hTERT-HPNE hasnyálmirigy sejtekhez képest. A foszforspecifikus antitest mindkét maradékon felismeri a foszforjeleket. Az összehangolt szekvenciák felül a tandem foszfor-szabályozó helyet körülvevő szekvenciákat mutatják. A tandemhelyen lévő szerin-maradványok (S307 & S309 az egér CAP1-en; S308 & S310 a humán CAP1-en) félkövérrel és dőlt betűvel (aláhúzva is) vannak kiemelve. A foszforjeleket denzitometriával számszerűsítettük, és három kísérlet eredményeit Student’s t-próbával elemeztük és ábrázoltuk a grafikonon, ahol a hibasávok az S.E.M. értéket jelölik. “*” a P < 0,05 és “**” a P < 0,01 értéket jelöli. (C) A sejtek GSK3-inhibitor 6-BIO-val történő 16 órás kezelése dózisfüggő módon jelentősen csökkentette a CAP1 foszforilációt mind a PANC-1 hasnyálmirigyrák sejtekben, mind a hTERT-HPNE sejtekben. A 6-BIO a CFPAC-1 sejtekben is hasonlóan csökkentette a CAP1 foszforilációt (nem látható). A GAPDH betöltési kontrollként szolgált a Western blottingban.
Korábban beszámoltunk arról, hogy a GSK3 foszforilálja az S309-et az egér CAP124-en (ami megfelel az S310-nek a humán CAP1-en; az összehangolt szekvenciákat az 1B. ábra mutatja). Tekintettel a GSK3 hasnyálmirigyrákban jelentett hiperaktiválódására25 , megvizsgáltuk a CAP1-en lévő S308/S310 foszforiláció lehetséges emelkedését a rákos sejtekben, olyan foszforspecifikus antitestet használva, amely Western blotting24 során mindkét szerinmaradványon felismeri a foszforjeleket. Érdekes módon az S308/310 foszforiláció jelentősen emelkedett a rákos sejtekben a kontroll sejtekhez képest (1B. ábra, csak a PANC-1 és CFPAC-1 sejtvonalak számszerűsített adataival látható, de hasonló eredményeket kaptunk az AsPC-1 és Mia PaCa-2 sejtek esetében is). Ezután a GSK3 gátlását a rákos sejtek 6-BIO (6-bromindirubin-3′-oxim)31 erős GSK3-inhibitorral történő kezelésével végeztük, és azt találtuk, hogy a kezelés dózisfüggő módon csökkentette a CAP1 S308/S310 foszforilációját a PANC-1 és CFPAC-1 sejtekben (1C. ábra, csak a PANC-1 sejtek esetében látható). A 6-BIO-val történő kezelés a CAP1 foszforilációját a kontroll hasnyálmirigy sejtekben is csökkentette. Következetesen egy szelektívebb GSK3-inhibitor, a LiCl32 is csökkentette a CAP1 foszforilációját a PANC-1 és AsPC-1 sejtekben, amint azt később bemutatjuk. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a GSK3 is része a CAP1 S308/S310 foszforilációs gépezetének a hasnyálmirigyrák sejtekben. Azt is megjegyezzük, hogy a rákos sejtek és a kontrollsejtek 6-BIO-val történő kezelése következetesen a CAP1 észrevehető felszabályozásához vezetett, egy ismeretlen mechanizmuson keresztül.
A CAP1 lekapcsolása fokozott stresszrostok, valamint a rákos sejtek csökkent motilitása és inváziója
A CAP1 csendesítésére tettünk kísérletet ezután, hogy meghatározzuk a CAP1 szerepét a hasnyálmirigy rákos sejtekben. Az általunk korábban kifejlesztett stabil knockdown paradigma kompatibilis egy mentési stratégiával, amely lehetővé teszi a CAP112,18,24 depletiójából származó fenotípusok specifitásának ellenőrzését. Két shRNS-konstrukció, az S2 és S3 segítségével, amelyek független nukleotidszekvenciákat céloztak meg, és hatékonyan csendesítették a CAP1-et HeLa- és emlőráksejtekben12,18,24,33, stabil klónokat tudtunk létrehozni hatékony CAP1-koppintással a PANC-1 és AsPC-1 sejtekben, amint azt a Western blotting is megerősítette (2A ábra). Neomicin-szelekcióval két stabil knockdown klónt hoztunk létre a PANC-1 (S2-1 és S3-3) és az AsPC-1 (S2-3 és S2-7) sejtekből. A CAP1 csendesítésére tett kísérletek a CFPAC-1 és a Mia PaCa-2 rákos sejtvonalakban azonban sikertelenek voltak. A CFPAC-1 sejtek nem képeztek kolóniákat az antibiotikumos szelekciót követően, míg a Mia PaCa-2 sejtekben a mintegy kéttucatnyi stabilan szűrt kolónia közül egyikben sem csökkent jelentősen a CAP1 expressziója (az adatok nem láthatóak).
A CAP1 redukálása rákos sejtekben fokozott aktin stresszrostokhoz, valamint csökkent sejtmotilitáshoz és invázióhoz vezetett. (A) Hatékony CAP1 knockdown két stabil klónban mind a PANC-1, mind az AsPC-1 sejtek esetében, amit Western blottinggal igazoltunk. A CAP1-et Western blottingban detektáltuk, ahol a GAPDH-t használtuk terhelési kontrollként. (B) A CAP1 depletiója a PANC-1 sejtekben fokozott aktin stresszrostokhoz vezetett. A shRNS üres vektorát hordozó kontroll sejtekben (Vec) nagyon korlátozottak voltak az aktin stresszrostok (nyilakkal jelölve). Ezzel szemben a CAP1-knockdown sejtekben (S2-1 és S3-3) az aktin stresszrostok felerősödtek (nyilakkal jelezve), amint azt a fluoreszcens mikroszkópia során a phalloidin festést követően megfigyeltük. (C) A CAP1 kimerítése csökkentette a motilitást mind a PANC-1, mind az AsPC-1 sejtekben, amint azt a sebgyógyulási és a Transwell-migrációs próbákban kimutatták (csak a PANC-1 esetében). A Transwell-migrációs vizsgálatokhoz ~2 × 104, egy éjszakán át szérummal éheztetett sejtet töltöttünk minden egyes, szérumot tartalmazó tápfolyadékkal töltött lyukba helyezett betétre. 16 óra elteltével a migrált sejteket pontoztuk, és három független kísérlet adatait gyűjtöttük össze, elemeztük Student’s t-próbával, és ábrázoltuk a grafikonon, ahol a hibasávok az S.E.M. értéket jelentik. “*” jelzi a P < 0,05 értéket az üres vektort (Vec) hordozó kontroll sejtekhez képest. (D) A CAP1 depletiója csökkentette a PANC-1 sejtek Matrigel-invazióját. A vizsgálatokat, valamint az adatgyűjtést és elemzést a Transwell-migrációs vizsgálatokhoz hasonlóan végeztük, azzal a különbséggel, hogy a betétmembránokat Matrigellel előzetesen bevontuk. A “*” a P < 0,05 értéket jelzi a kontrollsejtekhez képest. (E) Csökkent EMT a CAP1 knockdown PANC-1 sejtekben, amit a megnövekedett E-Cadherin expresszió, valamint a csökkent Vimentin expressziós szintek jeleznek a CAP1-knockdown stabil klónokban. A GAPDH betöltési kontrollként szolgál a Western blotokban.
Először morfológiai és aktin citoszkeletális változásokat vizsgáltunk a CAP1-knockdown PANC-1 és AsPC-1 sejtekben. A CAP1-knockdown HeLa és metasztatikus emlőráksejtek12,18,24 megnövekedett sejtméretével ellentétben a CAP1 depletiója nem okozott észrevehető méretnövekedést a PANC-1 és AsPC-1 sejtekben. Ezután a PANC-1 sejtek aktin citoszkeletonját festettük meg falloidinnal, majd fluoreszcens mikroszkópiát végeztünk. A PANC-1 sejtek (és általában a hasnyálmirigyrákos sejtek) az aktin citoszkeleton vizsgálatára általánosan használt sejtvonalakhoz, például a HeLa és NIH3T3 fibroblasztokhoz12,24 képest rosszul szervezett aktin citoszkeleton struktúrákkal rendelkeznek, különösen a stresszrostok tekintetében (2B ábra). Mindazonáltal a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben a kontroll sejtekhez képest fokozott stresszrostok voltak kimutathatók (2B. ábra). Mind a 26 vizsgált üres vektort hordozó kontrollsejt nagyon korlátozott stresszrostok jelenlétét mutatta. Ezzel szemben a vizsgált 27-ből 20-ban (74,1%) az S2-1 és 23-ból (78,3%) az S3-3 CAP1-knockdown sejtek közül 18-ban (78,3%) a 2B. ábrán láthatóhoz hasonlóan feltűnően erősödtek a stresszrostok. A stresszrostok felhalmozódását következetesen megfigyelték más CAP1-hiányos sejtekben12,13, egy fenotípus, amely feltehetően a CAP1-nek az aktin-monomerek szekvenálásában és az aktin-filamentum turnover elősegítésében betöltött funkciójának elvesztéséből ered.
A fokozott stresszrostokkal összhangban a CAP1-hiányról azt jelentették, hogy csökkenti a motilitást számos emlőssejttípusban, beleértve a rákos sejteket is13,14,17,18,19 . A CAP1 átmeneti kiütése hasnyálmirigyráksejtekben szintén csökkentette a sejtek mozgékonyságát sebgyógyulási vizsgálatokban14. A CAP1 stabil lekapcsolásának hatását a hasnyálmirigyráksejtek invazivitására sebgyógyulási próbák, Transwell-migrációs próbák, valamint Matrigel-invaziós próbák elvégzésével vizsgáltuk. A CAP1 kimerítése jelentősen csökkentette a sejtek mozgékonyságát a sebgyógyulási próbákban mind a PANC-1, mind az AsPC-1 sejtek esetében (2C. ábra), ami összhangban van a korábban közölt eredményekkel14. A CAP1-knockdown PANC-1 sejtek (mind az S3-3, mind az S2-1) sebei 24 órával a behelyezés után csak kis mértékben gyógyultak, míg a kontroll sejteknél a rés szinte teljesen kitöltődött. Hasonló hatást figyeltünk meg a stabil CAP1-knockdown AsPC-1 klónok S2-3 és S2-7 esetében is (2C ábra). A PANC-1 sejtek Transwell-migrációs vizsgálatainak eredményei összhangban voltak a sebgyógyulási vizsgálatok eredményeivel, amint azt az alsó panelen látható számszerűsített eredmények grafikonja mutatja (2C. ábra). Továbbá az inváziós próbákból kiderült, hogy a CAP1 depletiója szintén csökkentette a PANC-1 rákos sejtek Matrigelen keresztüli behatolási és inváziós képességét (2D ábra). A három független próbából gyűjtött adatok Student’s t-próbás elemzései szignifikánsan csökkent inváziót mutatnak a CAP1-knockdown PANC-1 stabil sejtekben (2D ábra). Végül, mivel az EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) összefügg a rákos sejtek invazivitásával, megvizsgáltuk a CAP1 knockdown lehetséges hatását az EMT-re. Valóban, a CAP1-knockdown PANC-1 sejteknél az E-Cadherin felfelé szabályozódott, ami csökkent EMT-re utal (2E. ábra). Egy másik EMT-markert, a Vimentint is vizsgáltuk, és azt találtuk, hogy a CAP1 kimerítése csökkentette az expresszióját (2E ábra). Ezek az eredmények együttesen alátámasztják a CAP1 szükséges szerepét a PANC-1 rákos sejtek invazivitásában és EMT-jében.
A GSK3 gátlása, amely elnyomja a CAP1 foszforilációját, csökkentette a rákos sejtek mozgékonyságát és invázióját
A korábbi eredményeink arra utalnak, hogy az átmeneti foszforiláció kulcsfontosságú a CAP1 funkciójához az aktin citoszkeleton szabályozásában24. A hasnyálmirigyráksejtekben a CAP1 emelkedett foszforilációja, amely összhangban van az aktivált GSK3-mal, arra utal, hogy a foszfor-szabályozásnak is szerepe lehet a CAP1 funkciójában a rákos sejtek invazivitásában. Ezt a lehetőséget a GSK3 gátlásával teszteltük, amely elnyomja az S308/S310 foszforilációt, és eközben megzavarja a CAP1 szabályozását a szabályozó helyen történő átmeneti foszforiláció révén. A PANC-1 sejteket 6-BIO-val kezeltük, majd sejtmigrációs és inváziós vizsgálatokat végeztünk. Először az 5 μM 6-BIO-val történő kezeléssel (1C. ábra) csökkentett S308/S310 foszforiláció CAP1-re gyakorolt hatását vizsgáltuk. Amint a 3A. ábrán látható, a 6-BIO kezelés jelentősen csökkentette a PANC-1 sejtek mozgékonyságát mind a sebgyógyulási, mind a Transwell-migrációs próbákban. Azt is megerősítettük, hogy a PANC-1 és AsPC-1 sejtek egy másik GSK3-inhibitorral, LiCl-lel történő kezelése csökkentette a CAP1 foszforilációt, valamint a sejtek mozgékonyságát a sebgyógyulási próbákban (3A,B ábra). Továbbá a 6-BIO kezelés a PANC-1 sejtek Matrigel-invazióját is csökkentette (3C ábra). Végül, mivel ismert, hogy a GSK3 a sejtfunkciók széles skáláját szabályozza számos szubsztrátmolekulán keresztül, a GSK3-gátlás sejtmotilitásra gyakorolt hatása valószínűleg kollektív kimenet a citoszkeleton, a sejtpolarizáció és a migráció szabályozásában részt vevő több GSK3-célponton keresztül34,35 . Ezért megvizsgáltuk és összehasonlítottuk a 6-BIO sejtmotilitást csökkentő hatását a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben és a kontroll sejtekben. Amint az a 3D ábrán látható grafikonon látható, a 6-BIO kezelés jelentősen csökkentette a kontroll (Vec) sejtek motilitását, de nem a CAP1-knockdown (S2-1 és S3-3) sejtekét a sebgyógyulási vizsgálatokban. Összességében ezek az eredmények alátámasztják, hogy az S308/S310-en keresztül történő foszfor-szabályozás fontos szerepet játszik a CAP1 számára a motilitás és az invázió elősegítésében a hasnyálmirigyrák sejtekben.
A GSK3 gátlása, amely csökkentette a CAP1 foszforilációját, szintén veszélyeztette a rákos sejtek motilitását és invázióját. (A) A PANC-1 sejtek 6-BIO-val vagy LiCl-lel történő kezelése csökkentette a sejtek mozgékonyságát a sebgyógyulási és a Transwell-migrációs próbákban. A 100 mM LiCl-lel történő kezelés hatékonyan csökkentette a CAP1 foszforilációt a PANC-1 sejtekben is. A PANC-1 sejtekkel végzett transzwell-migrációs vizsgálatokat a 2. ábrán leírtakhoz hasonlóan végeztük, ahol az NT a 6-BIO kezelés nélküli sejteket jelöli. (B) A 100 mM LiCl-kezelés szintén észrevehetően csökkentette a CAP1 foszforilációt az AsPC-1 sejtekben, valamint a sejtek mozgékonyságát a sebgyógyulási próbákban. (C) A PANC-1 sejtek 5 μM 6-BIO-val történő kezelése jelentősen csökkentette a rákos sejtek invázióját a Matrigel-invaziós próbákban. A Matrigel-invaziós próbákat, beleértve az adatgyűjtést és az elemzéseket is, a 2D ábrán leírtakhoz hasonlóan végeztük. (D) A CAP1 knockdownja a PANC-1 sejtekben veszélyeztette a 6-BIO hatását a sejtek mozgékonyságának csökkentésében a sebgyógyulási próbákban. A kontroll és a CAP1-knockdown stabil PANC-1 klónokat a seb bevezetését követően 16 órán át tenyésztettük, a szaggatott vonalak a kezdeti rés széleit jelzik. A sejtek motilitását számszerűsítettük, Student’s t-próbával elemeztük és ábrázoltuk a grafikonon, ahol a hibasávok a standard eltérést jelentik. A “*” a P < 0,05 és a “**” a P < 0,01 értéket jelzi.
A CAP1 foszformutánsainak károsodott funkciói voltak a fokozott stresszrostok enyhítésében és a lamellipodiák fejlődésének elősegítésében a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben
A CAP1-knockdown sejtekből származó eredményeink alátámasztják, hogy a CAP1 szükséges a rákos sejtek motilitásához és inváziójához, és a GSK3-gátlásból származó eredmények arra utalnak, hogy az S308/S310 foszforiláció kulcsszerepet játszik a CAP1 funkcióiban. Ezután újrakifejezési stratégiát alkalmaztunk ezen esetek további megállapítására. A vad típusú CAP1-et (WTCAP1) és a CAP1 foszformutánsait, amelyek a CAP1 foszforilált (S307D/S309D; DD) vagy foszforilálhatatlan (S307A/S309A; AA) formáit utánozzák, ahogyan azt korábban leírtuk12,18,24, stabilan reexprimáltuk a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben, hogy teszteljük az aktin citoszkeletális és sejtmorfológiai fenotípusok megmentésére való képességüket. Ezek a mutánsok eltéréseket tartalmaznak az S3 shRNS célszekvenciájához, hogy a knockdown sejtekben stabilan jelen lévő shRNS ne ismerje fel a származtatott mRNS-t, de a CAP112 egyetlen aminosavának módosítása nélkül. Stabil klónokat tudtunk létrehozni, amelyek újraexprimálják a WT egér CAP1-et, vagy az AA és DD foszfor mutánst, amint azt a 6xHis taggel szembeni Western blotting megerősítette (4A. ábra). Megjegyezzük, hogy az eredeti Western blot-képből két irreleváns sávot eltávolítottunk (az e két sávban lévő mintákat a két szerin-36 foszformutáns N-terminálison történő újrakifejeződésének megerősítésére használtuk). Az eredeti Western blot eredményének teljes sorozata az 1. kiegészítő ábrán látható. Az AA (AA-R) vagy DD (DD-R) mutánst reexprimáló sejtek morfológiáját fázismikroszkópiával vizsgáltuk, és összehasonlítottuk a WTCAP1-et reexprimáló (WT-R) sejtek morfológiájával. Arról számoltak be, hogy a CAP1 kiütése néhány emlőssejttípusban, beleértve a HeLa és metasztatikus emlőráksejteket, jelentősen megnövekedett sejtméretet eredményezett12,13,18, és ezt a fenotípust korábban megerősítettük, hogy a CAP112,18 kiütésére specifikus. A CAP1-knockdown a PANC-1 sejtekben vagy az AsPC-1 sejtekben azonban nem mutatta ezt a hatást. Ehelyett a WTCAP1 vagy a foszformutánsok stabil reexpressziója a knockdown sejtekben valójában jelentősen növelte a sejtméretet (4B. ábra). Sőt, a WTCAP1 reexpressziója robusztus méretű lamellipodiák (nyilakkal jelölve) kialakulásához vezetett, egy olyan szubcelluláris struktúrához, amely filamentózus aktinban gazdag és kritikus fontosságú a sejtek irányított mozgásának irányításában (4C. ábra), míg az üres kontrollvektort hordozó knockdown sejtek közül gyakorlatilag egyikben sem alakultak ki ilyen lamellipodiák. Az újraexprimált AA vagy DD mutáns szintén bizonyos mértékben serkentette a lamellipodiák képződését, de ezek mérete észrevehetően kisebb volt a WTCAP1-et újraexprimáló sejtekhez képest (nyilakkal jelölve a 4C ábrán). Minden sejttípus esetében 200 sejtet számoltunk meg, és a nagyméretű lamellipodiákat tartalmazó sejtek százalékos aránya a következő volt: 0% (0/200) a knockdown sejteknél (Vec), 14,5% (29/200) a WT-R sejteknél, és 9% (18/200), illetve 7,5% (15/200) az AA-R és DD-R sejteknél.
A WTCAP1 és a foszformutánsok reexpressziójának hatása a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben az aktin citoszkeletonra, a sejtméretre és a lamellipódia fejlődésére. (A) A WTCAP1 és az AA és DD foszformutánsok reexpressziójának megerősítése S3-3 CAP1-knockdown PANC-1 stabil sejtekben Western blottingban a 6xHis tag elleni antitest használatával. Két irreleváns sávot eltávolítottunk az eredeti Western blot-képből (az 1. kiegészítő ábrán látható); (B) számszerűsített adatok, amelyek a CAP1-knockdown sejtekben a WTCAP1-et vagy a foszformutánsokat reexprimáló sejtek jelentősen megnövekedett sejtméretét mutatják. Mezőnként 50 sejt méretét mértük az Image-J programmal. Az adatokat Student’s t-próbával elemeztük és ábrázoltuk a grafikonon, ahol a hibasávok a standard eltérést jelzik. A “*” jelzi a P < 0,05 értéket az üres vektort (Vec-R) hordozó kontrollsejtekhez képest. (C) A fázisképek azt mutatják, hogy a WTCAP1 vagy a foszformutánsok reexpressziója serkentette a lamellipodiák képződését. A WTCAP1-et reexprimáló sejtek egy része (WT-R) rendkívül nagy méretű lamellipodiákat fejlesztett ki (nyilakkal jelölve). Az AA (AA-R) vagy DD (DD-R) mutáns reexpressziója szintén lamellipódiumok képződését szimulálta, de ezek mérete észrevehetően kisebb a WTCAP1-et reexprimáló sejtekéhez képest. Az üres vektort (Vec-R) hordozó kontroll CAP1-knockdown sejtekben ilyen lamellipodiák nem voltak megfigyelhetők. (D) A WTCAP1 reexpressziója a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben csökkentette a stresszrostokat, míg a mutánsokat reexprimáló sejtekben a stresszrostok megnövekedtek. A foszfor-mimetikus DD mutánst reexprimáló sejtek rendelkeztek a leginkább fokozott stresszrostokkal. A nyilak jelzik a stresszrostokat, illetve azok hiányát a WT-R sejtek esetében.
A következőkben azt vizsgáltuk, hogy a foszformutánsok képesek-e enyhíteni a CAP1-knockdown PANC-1 sejtek fokozott stresszrostjait. Ahogy a 4D. ábrán látható konfokális felvételeken látható, a WTCAP1 (WT-R) újrakifejezése hatékonyan enyhítette a fokozott stresszrostokat, ezáltal megmentve a fenotípust, és a stresszrostok a nyíllal jelzett nagy területeken feloldódtak. Ezzel szemben a foszformutánsok kevésbé voltak hatékonyak a fokozott stresszrostok enyhítésében. Az AA mutánst reexprimáló sejteknek a WTCAP1 által megmentett sejtekhez képest szerényen fokozott stresszrostjai voltak, míg a DD mutánst reexprimáló sejtek még inkább fokozott stresszrostokkal rendelkeztek. Ezek az eredmények összhangban vannak a HeLa sejtekből származó korábbi eredményeinkkel, amelyek szerint a defoszforilált CAP1 az “aktív” forma a foszforilált CAP124-hez képest, míg az átmeneti foszforiláció feltételezhetően szükséges a CAP1 optimális sejtfunkcióihoz. Ezek az eredmények arra is utalnak, hogy az átmeneti S308/S310 foszforiláció fontos ahhoz, hogy a CAP1 szabályozza az aktin citoszkeleton működését a hasnyálmirigyrák sejtekben; az átmeneti foszforiláción keresztül történő szabályozás megzavarása a CAP1 funkciójának hibáihoz vezet az aktin filamentum turnover elősegítésében.
A CAP1 foszformutánsok hibásan mentették meg a CAP1-knockdown rákos sejtek csökkent invazivitását
Mivel a dinamikus aktin filamentum turnover a sejtmozgás elsődleges hajtóereje, ezután azt vizsgáltuk, hogy a foszformutánsok mennyire mentik meg a CAP1-knockdown PANC-1 sejtek csökkent sejtmotilitását és invázióját. Először Transwell-migrációs próbákat végeztünk, és azt találtuk, hogy a WTCAP1 reexpressziója jelentősen növelte a sejtek mozgékonyságát az üres vektort hordozó kontrollsejtekhez képest, amint azt az ábrán (5A. ábra) látható számszerűsített eredmények mutatják. Az újraexprimált AA mutáns (AA-R), bár nem volt olyan hatékony, mint a WTCAP1, részben megmentette a csökkent sejtmotilitást a Transwell-migrációs próbákban. Ezzel szemben a DD mutáns (DD-R) nem mentette meg a csökkent sejtmotilitást, és az arány hasonló volt az üres vektort hordozó CAP1-knockdown sejtekéhez. Ezek az eredmények összhangban vannak a WTCAP1 és a foszfor mutánsok által a fokozott stresszrostok megmentésének képességeivel. A CAP1-knockdown sejtekben tovább vizsgáltuk a csökkent Matrigel-invazio megmentését, amint azt az 5B. ábrán látható számszerűsített eredmények mutatják. Hasonlóképpen, a WTCAP1 mentette meg leghatékonyabban a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben a csökkent inváziót; az AA mutáns részleges mentést ért el, míg a DD mutáns szó szerint nem mentette meg a fenotípust. Végül, a WTCAP1 reexpressziója a CAP1-knockdown sejtekben szintén csökkentette az E-Cadherin expresszióját (5C. ábra), ami tovább erősíti, hogy a CAP1 szükséges az EMT-hez a PANC-1 rákos sejtekben. Ezek az eredmények együttesen alátámasztják, hogy az S308/S310 tandemhelyen keresztül történő foszforszabályozás fontos szerepet játszik a CAP1 számára a hasnyálmirigyráksejtek mozgékonyságának és inváziójának elősegítésében.
A WTCAP1 és a foszformutánsok hatása a csökkent motilitás és invázió megmentésében a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben. (A) A WTCAP1 és az AA mutáns hatékonyan mentette meg a CAP1-knockdown PANC-1 sejtek csökkent motilitását Transwell-migrációs próbákban, míg a DD mutánsnak ez nem sikerült. A kísérleteket, az adatgyűjtést és az elemzéseket a 2. ábrán leírtakhoz hasonlóan végeztük. A hibasávok S.E.M. értékeket jelölnek, a “*” pedig a P < 0,05 értéket jelzi az üres vektort (Vec-R) hordozó kontrollsejtekhez képest. (B) A WTCAP1 és az AA mutáns hatékonyan mentette meg a CAP1-knockdown PANC-1 sejtek csökkent Matrigel-invazíváját, míg a DD mutáns szintén nem tette ezt. A kísérleteket, az adatgyűjtést és az elemzéseket a 2. ábrán leírtakhoz hasonlóan végeztük. A hibasávok S.E.M. értékeket jelölnek, a “*” pedig a P < 0,05 értéket jelzi a kontroll sejtekhez képest. (C) A WTCAP1 reexpressziója szintén megmentette a CAP1-knockdown PANC-1 sejtekben felfelé szabályozott E-Cadherint.
Evidence supporting that CAP1 mediates extracellular growth factor signals to control cancer cell invasiveness
Physiological stimuli, such as growth factors PDGF and HGF (Hepatocyte Growth Factor)36 , are known to stimulate rearrangement of the actin cytoskeleton and cell migration. Mivel az S308/S310 foszfor-szabályozás kulcsfontosságú a CAP1 funkciói szempontjából az aktin citoszkeleton és a rákos sejtek invazivitásának szabályozásában, megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy ezek az ingerek szabályozhatják a CAP1 foszforilációját, és ezen keresztül az aktin citoszkeleton átrendeződését és a rákos sejtek invazivitását. Érdekes módon a szérum-éheztetett PANC-1 és AsPC-1 sejtek PDGF-fel történő kezelése csökkentette a CAP1 S308/S310 foszforilációját, a legjelentősebb mértékben az 5 perces időpontban (6A,B ábra). A hasnyálmirigyrák-sejtek HGF-fel vagy szérummal történő kezelése nem volt jelentős hatással a CAP1 defoszforilációjának indukálására (2. kiegészítő ábra; a PANC-1 sejtek esetében látható). Ezért valószínűleg a CAP1-en keresztül történő jelátvitel legalább részben felelős azért, hogy a PDGF serkenti az aktin citoszkeletális átrendeződést és a rákos sejtek invazivitását. Ezek az eredmények összhangban vannak azzal az elképzeléssel is, hogy a defoszforilált CAP1 az “aktív” forma, amint arra több bizonyíték is utal, beleértve a cofilin kötődést, a foszformutánsok szubcelluláris lokalizációját és a CAP1 emelkedett foszforilációját szuszpenzióban tenyésztett sejtekben24. A CAP124 optimális sejtfunkcióihoz azonban feltételezhetően szükség van az átmeneti foszforilációra a tandem szabályozóhelyen, azaz a foszforilált és a defoszforilált forma közötti ciklikus váltakozásra. A CAP1-foszforilációs jelek valószínűleg a CAP1-foszforilációs jelekkel együttesen működnek, hogy a CAP1 sejtfunkciókat az S308/S310-en történő átmeneti foszforiláció irányításával szabályozzák.
PDGF indukálta CAP1-foszforiláció a hasnyálmirigyrák sejtekben. (A) A szérum-éheztetett AsPC-1 rákos sejtek PDGF-fel történő kezelése a CAP1 S308/S310-es foszforilációját indukálta. A sejteket egy éjszakán át tenyésztettük, 24 órán át szérum-éheztettük, majd 30 ng/ml PDGF-fel kezeltük a jelzett időtartamokon keresztül. Sejtlizátumokat készítettünk, majd Western blottingot végeztünk foszforspecifikus antitesttel, amely a CAP1 tandem szabályozóhelyének mindkét maradékán detektálja a foszfor jeleket. A defoszforilációs hatás a PDGF-kezelés 5 perces időpontjában volt a legjelentősebb. (B) A széruméheztetett PANC-1 sejtek PDGF-fel történő kezelése szintén figyelemre méltó CAP1-foszforilációt indukált, az AsPC-1 sejtekhez hasonló módon. A sejtek kezelését és a Western blottingot az AsPC-1 sejteknél alkalmazott eljárásokkal megegyezően végeztük. A Western blotban a GAPDH szolgált terhelési kontrollként.
A CAP1 depletiója hasnyálmirigyrák sejtekben csökkentette a FAK aktivitást, de nem okozott változásokat az ERK-ban vagy a sejtproliferációban
A közelmúltban azonosítottuk a CAP1 új szerepét az emlőráksejtek proliferációjának szabályozásában, ahol a CAP1 depletiója sejtkontextusfüggő hatást gyakorol a proliferációra, ami az ERK aktivitás következetes változásával jár együtt18. Megvizsgáltuk, hogy a CAP1 szabályozhatja-e az ERK-t és a proliferációt hasnyálmirigyráksejtekben is. A CAP1-knockdown PANC-1 stabil klónokban nem észleltünk jelentős változásokat az ERK expressziójában vagy foszforilációjában a kontrollsejtekhez képest (3A. kiegészítő ábra). Az S2-1 és S3-3 stabil knockdown sejtek proliferációját vizsgáló és a kontroll (Vec) sejtekkel összehasonlító MTT vizsgálatokat is végeztünk, és a knockdown sejtekben enyhén csökkent sejtproliferációs arányt észleltünk (3B. kiegészítő ábra). A különbségek azonban statikailag nem voltak szignifikánsak, az S2-1 sejtek és a kontroll sejtek közötti O.D. (570 nm-en) összehasonlító P értékek 0,219, az S3-3 sejtek és a kontroll sejtek közötti P érték pedig 0,223 volt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a CAP1 nem játszik jelentős szerepet a hasnyálmirigyrák sejtek proliferációjának szabályozásában. Továbbá, tekintettel arra az általános tendenciára, hogy a stabil knockdown paradigma hajlamos a klónvariációkra, a CAP1 stabil knockdown PANC-1 sejtek pooljait hoztuk létre, amelyekről úgy véljük, hogy pontosabban tükrözik a CAP1-depléció ERK-ra gyakorolt hatásait, elkerülve a szelekciós torzítás lehetséges befolyását. Amint az a 7A. ábrán látható, az S2 és S3 shRNS-konstrukciókból származó, hatékony CAP1-koppintással rendelkező stabil PANC-1 sejtek pooljai jöttek létre a neomicin-szelekciót követően, amit a Western blotting is megerősített. A stabil knockdown klónok használatából származó eredményekkel összhangban a knockdown pool sejtekben a kontroll pool sejtekhez képest nem észleltünk figyelemre méltó változásokat az ERK expressziójában vagy foszforilációjában.
A CAP1-knockdown PANC-1 pool sejtekben csökkent FAK aktivitás és sejtadhézió, de nem volt változás az ERK-ban. (A) Az S2 és S3 shRNS-konstrukciókból származó CAP1-knockdown PANC-1 pool sejtek nem mutattak megváltozott ERK-expressziót vagy -aktivitást az üres vektort hordozó kontroll pool sejtekhez képest, amint azt Western blottinggal kimutatták. Az ERK-aktivitást Western blottingban a Thr202/Tyr204 helyek elleni foszforspecifikus ellenanyaggal mutattuk ki. A GAPDH betöltési kontrollként szolgált. (B) A CAP1-knockdown PANC-1 pool sejtekben csökkent FAK aktivitást detektáltunk a kontroll pool sejtekhez képest. A FAK-aktivitást a Tyr397-es foszforilációval vizsgáltuk, a Western blottingban a hely elleni foszfor-specifikus antitestet használva; (C) A CAP1-knockdown pool sejteknél csökkent a sejtek adhéziója a vizsgált időpontokban (45 perc és 2 óra) a sejtek fibronectinnel bevont lemezekre történő kiültetését követően. Körülbelül 2 × 104 sejtet ültettünk egy 6 lyukú lemez minden egyes lyukába, és a jelzett időpontokban nem tapadó sejteket lemostuk. Öt véletlenszerű mezőben fázismikroszkóp alatt megszámoltuk a kötődött sejtek számát, és képeket készítettünk. (D) A három független sejtadhéziós vizsgálatból gyűjtött adatokat Student’s t-próbával elemeztük, és ábrázoltuk a grafikonon, ahol a hibasávok a standard eltérést jelölik. “**” P < 0,01-et jelez az üres vektort hordozó kontrollsejtekhez képest.
A CAP1 redukciója emlőráksejtekben a FAK különböző változásait okozta a metasztatikus és nem metasztatikus emlőráksejtekben18. A CAP1-knockdown PANC-1 medence rákos sejtjeiben szintén csökkent FAK-aktivitást észleltünk, a FAK expressziós szintjének változása nélkül (7B. ábra). Ezen eredmények alapján tovább vizsgáltuk a CAP1-depléció sejtadhézióra gyakorolt hatását adhéziós próbákban, hasonlóan a korábban elvégzettekhez12,18. Megállapítottuk, hogy a CAP1-knockdown pool sejtek mindkét shRNS-konstrukcióból származó sejtjei a kontrollsejtekhez képest feltűnően csökkent sejtadhéziót mutattak (7C. ábra). Mindkét időpontban (45 perc és 2 óra), miután a sejteket fibronectinnel bevont felületre telepítettük, szignifikánsan több kontroll sejt tapadt a CAP1-knockdown pool sejtjeihez képest. Továbbá a CAP1-knockdown sejtekhez képest több csatolt kontroll sejt is teljesen szétterjedt (lamellipodiák fejlődtek ki, és a sejtek nem mutatnak olyan fényesen) (7C. ábra). Az összehasonlításhoz három mezőből pontoztuk a csatolt sejtek számát, és három független kísérletből származó adatokat számszerűsítettük, ahogyan azt a grafikonon ábrázoltuk (7D ábra).