A kolinhiány mérsékli a testsúlygyarapodást és javítja a glükóztoleranciát ob/ob egerekben

Abstract

A korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a kolinellátottság közvetlenül összefügg a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízással és inzulinrezisztenciával egerekben. E vizsgálat célja annak felmérése volt, hogy a kolinellátás modulálhatja-e a genetikai hiba által okozott elhízást és inzulinrezisztenciát is. Nyolchetes hím ob/ob egereket két hónapon keresztül kolinhiányos vagy kolinnal kiegészített étrenddel etettek. Megvizsgálták a szövetek tömegét, beleértve a zsírtömeget és a sovány tömeget. Az intracelluláris jelátvitelt, a plazma glukagon- és inzulinszintjét, valamint a glükóz- és inzulin-tolerancia teszteket is vizsgálták. A kolinhiányos étrend lassította a testtömeg-gyarapodást és csökkentette a zsírtömeget. A kolinhiány szintén csökkentette a plazma glükózszintjét, és javította a glükóz- és inzulintoleranciát, bár a zsírmáj súlyosbodott. A kolinhiányos étrend hatására megnövekedett zsírszöveti lipolitikus aktivitás, csökkent plazma glukagonszint és a máj glukagonreceptorának csökkent expressziója is megfigyelhető volt. Eredményeink azt mutatják, hogy a kolinhiányos étrend csökkentheti a zsírtömeget és javíthatja a glükóztoleranciát genetikai hiba miatt elhízott és cukorbeteg egerekben.

1. Bevezetés

A kolin fontos étrendi tényező, amely részt vesz néhány kulcsfontosságú folyamatban, mint például a neurotranszmitter acetilkolin és a fő membránkomponens foszfatidil-kolin (PC) bioszintézisében . A PC vagy a CDP-kolin útvonalon, vagy a foszfatidil-etanolamin foszfatidil-etanolamin N-metiltranszferáz (PEMT) általi metilálásával szintetizálható. A PEMT útvonal csak a májban mennyiségi szempontból jelentős . A kolin az acetilkolin neurotranszmitter alapvető prekurzora is, amely a muszkarin és nikotin acetilkolin receptorokon keresztül hat. Az elmúlt években nyilvánvalóvá vált a kolin és az elhízás/diabétesz közötti lehetséges kapcsolat . Javasolták, hogy a muszkarin acetilkolin receptorok az elhízás terápiás célpontjai lehetnek . Nemrégiben azt találtuk, hogy a PEMT hiánya megvédheti az egereket a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízástól és inzulinrezisztenciától. Ez a védelem azonban megszűnt, amikor a magas zsírtartalmú étrendhez nagy dózisú kolint adtunk . A PC-katabolizmus által követett PEMT-útvonal a kolin egyetlen ismert bioszintetikus útja az emlősökben . A PEMT-hiányos egerekben a kolintartalom jelentős csökkenését találták számos szövetben (Li és munkatársai, nem publikált adatok), ami közvetlen kapcsolatot teremt a kolin és a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízás/inzulinrezisztencia között. Jelen vizsgálatban ob/ob egereket etettünk kolinhiányos (CD) étrenddel, hogy felmérjük, hogy a kolinhiány is módosíthatja-e a genetikai eredetű elhízást és az inzulinrezisztenciát.

2. Anyag és módszerek

2.1. Az anyag és a módszerek

2.1. Az ob/ob egerek táplálása. Állatok és étrend

Minden eljárást az Albertai Egyetem intézményi állatgondozási bizottsága hagyott jóvá a Kanadai Állatgondozási Tanács irányelveinek megfelelően. A The Jackson Laboratory-tól származó 8 hetes hím ob/ob egereket 1 hétig akklimatizálták. Minden csoportban 5 egeret használtunk. Az egerek 2 hónapig szabadon hozzáférhettek kolinhiányos (CD) vagy kolinnal kiegészített (CS) táplálékhoz. A CD étrend (MP Biomedicals Canada, katalógusszám: 901387) 20% zsírt tartalmazott sertészsír formájában. A CS-táp a CD-tápból állt, amelyhez 0,4% (m/m) kolinkloridot adtak. Az egereket izofluránnal történő elaltatással, majd szívpunkcióval áldozták fel.

2.2. Testsúlygyarapodás, sovány tömeg és zsírtömeg mérése

A testsúlyt hetente mértük. A sovány tömeget és a zsírtömeget 2 hónappal az egerek diétára állítása után (premortem) elemeztük az EchoMRI rendszer segítségével.

2.3. Glükóz- és inzulin-tolerancia teszt

Glükóz-tolerancia teszt: 12 órás koplalást követően az egerek sterilizált foszfát pufferelt sóoldatban (PBS) oldott 0,5 g dextróz/kg testtömegű, intraperitoneális injekciót (i.p.) kaptak. Inzulin-tolerancia teszt: 6 órás koplalást követően az egerek 1,0 egység inzulin (Sigma)/kg testsúlyban, PBS-ben lévő inzulint kaptak i.p. injekcióban. A vér glükózkoncentrációját glükométerrel mértük a farokvérzésben az injekció beadása előtt és a jelzett időpontokban az injekciót követően.

2.4. A mitokondriális komplex I/II aktivitás mérése

A mitokondriális komplex I és II aktivitását mitokondriális fehérje felhasználásával határoztuk meg. Röviden, a mitokondriális fehérje izolálásához a mintákat jégen tartottuk és homogenizáltuk 75 mM szacharózt, 225 mM szorbitot, 1 mM EGTA-t és 0,1% zsírsavmentes szarvasmarha szérum albumin 10 mM Tris-HCl pH 7,4-ben lévő pufferben. A homogenátumot 15 percig 600× g-nél centrifugáltuk, majd a kapott felülúszót 20 percig 16 200 rpm-en centrifugáltuk tovább. A pelletben lévő mitokondriális fehérjét 20 mM Tris-t és 25 mM szukrózt tartalmazó pufferben (pH7,4) szuszpendáltuk, és felhasználásig -80°C-on tároltuk. Az aktivitás mérését spektrofotométeren végeztük 5 percig a 600 nm-en mért abszorbancia csökkenésként, amely a 2,6-diklórfenol-indofenol (DCPIP) ubikinon-1-re történő redukciója miatt következett be NADH (az I. komplex szubsztrátja) vagy szukcinát (a II. komplex szubsztrátja) jelenlétében. A reakciót antimicin és kálium-cianid mint a III. és IV. komplex inhibitor jelenlétében végeztük. Az I. komplex inhibitoraként a komplex II aktivitását gátló rotenon is részt vett a reakció pufferében.

2.5. Hisztológia és immunoblotting

A szövettanhoz a májakat vagy zsírpárnákat 10%-os formaldehidbe PBS-ben boncoltuk, majd a rutinszerű hematoxilin és eozin festés következett. Az immunoblottinghoz a májminták homogenizálását és 600× g-n történő centrifugálását követően az így kapott felülúszókat fehérjekoncentráció-meghatározásnak vetettük alá (BioRad), hogy biztosítsuk az azonos mennyiségű fehérjék SDS-PAGE-ra történő betöltését. A hormonérzékeny lipáz (foszfo-HSL/teljes HSL), foszfenolpiruvát-karboxikináz, (PEPCK), acetil-CoA-karboxiláz (foszfo-ACC/teljes ACC) és AMP-aktivált protein kináz (foszfo-AMPK/teljes AMPK) elleni összes primer antitestet a Cell Signaling cégtől vásároltuk. A piruvát-dehidrogenáz kináz izoenzim 4 (PDK4), glükagon receptor elleni antitesteket az Abcam-tól szereztük be, de a citokin jelátvitel szuppresszor 3 (SOCS3) és a PGC-1α a Santa Cruz Biotechnology-tól származott. a Tublin vagy az aktin betöltési kontrollként szolgált a normalizáláshoz. A képet az ImageJ szoftverrel elemeztük.

2.6. Plazma inzulin és glükagon mérés

A méréseket egér/patkány glükagon, inzulin assay kit (Meso Scale Discovery) segítségével végeztük a cég utasításai alapján.

2.7. Statisztikai elemzés

Az adatok átlag ± SD értékben vannak feltüntetve. A különbségeket a Student’s t-próbával értékeltük. Az 𝑃<0,05 értéket szignifikánsnak tekintettük.

3. Eredmények

A kolinhiányos étrend szignifikánsan lassította a testsúlygyarapodást 2 hónapig (1. ábra (a)) anélkül, hogy befolyásolta volna a táplálékfogyasztást (napi táplálékfelvétel 7,21±1,23 g a CD egereknél versus 7,39±1,31 g a CS egereknél, 𝑃>0,05). A két csoport között szignifikáns különbség volt a kiindulási testsúlyban (30,42±1,70 g a CD egereknél versus 26,3±2,26 g a CS egereknél, 𝑃=0,01). A kolinhiány nem befolyásolta a szív, a máj vagy a vese súlyát (1. ábra (b)), de a mellékhere és a perirenális zsír súlya jelentősen csökkent (1. ábra (c)). A mágneses rezonanciás képalkotás segítségével végzett további elemzés azt mutatta, hogy a kolinhiány csökkentette az egész test zsírtömegét, ugyanakkor növelte a sovány tömeget, függetlenül attól, hogy abszolút tömegben vagy az egész test tömegéhez viszonyított relatív százalékos arányban fejezték ki (1. ábra (d)). A kolinhiány növelte a zsírszöveti foszfohormon-érzékeny lipáz, az enzim aktivált formájának expresszióját (1. ábra (e)). A kolinhiány viszont nem változtatta meg a zsírszövet morfológiáját (1. ábra (f)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

1. ábra

Choline…hiányos étrend mérsékli a testsúlygyarapodást és fokozza a zsírzsír lipolitikus kapacitását. A 8 hetes hím ob/ob egerek 2 hónapig szabadon hozzáférhettek a CD vagy CS étrendhez. Megmértük a testtömeg-gyarapodást (a), a szövetek tömegét (b), az epididymális és perirenális zsírtömeget (c), valamint a zsír- és sovány tömeget (d). A foszfo- és teljes hormonérzékeny lipáz fehérjeexpresszióját a zsírszövetben immunoblottinggal vizsgáltuk (e). A zsírpárna metszeteket H & E-vel festettük (f). ∗∗𝑃<0,01 és ∗𝑃<0,05 a CS csoporthoz képest.

A testsúly befolyásolása mellett a kolinhiány csökkentette az éhomi plazma glükóz (14,3±1,67 versus 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) és a glükagon szintjét (2. ábra (a)), bár a plazma inzulin szintjére nem volt hatással (2. ábra (b)). A kolinhiányos étrenden tartott egereknél jelentősen javuló glükóz- és inzulinintolerancia volt megfigyelhető (2(c)-2(d) ábrák). A mögöttes mechanizmus vizsgálatára a glükózoxidáció kulcsenzimjeit elemezték. A kolinhiány csökkentette a PDK4 (3(a) ábra), a piruvát-dehidrogenáz aktivitásának negatív szabályozója, amely a mitokondriális acetil-CoA beáramlását szabályozza, májfehérje-expresszióját, ami fokozott glükózhasznosításra utal. Hasonlóképpen csökkent a hepatikus PGC-1α (a PDK4 jól ismert upstream modulátora) és a PEPCK (a PGC-1 α downstream célpontja és a glükoneogenezis egyik kulcsenzime) (3. ábra (b)), ami csökkent glükoneogenezisre utal. Megvizsgáltuk továbbá, hogy a javuló glükóz- és inzulinintolerancia összefüggésbe hozható-e a májgyulladás és a mitokondriális funkció változásával. Sem a proinflammáció markerének, a SOCS3 fehérjeexpresszióját (3. ábra (c)), sem a mitokondriális citrát-szintáz aktivitását nem befolyásoltuk (az adatok nem láthatóak). A mitokondriális II-es komplex, de nem az I-es komplex aktivitását azonban szignifikánsan csökkentette a kolinhiány (3. ábra (d)). Érdekes, hogy a máj glükagonreceptorának fehérjeexpresszióját is csökkentette a kolinhiány (3. ábra (e)).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

3. ábra

Az ob/ob egerek inzulinérzékenységének javulásában szerepet játszó molekuláris mechanizmusok a kolin-hiányos étrenden. A 8 hetes hím ob/ob egerek 2 hónapig szabadon hozzáférhettek a CD vagy CS étrendhez. A PDK4 (a), a PEPCK, a PGC-1α (b), a SOCS3 (c) és a glükagonreceptor (e) hepatikus fehérjeexpresszióját immunoblottinggal vizsgáltuk. A mitokondriális komplex I és II aktivitását is megmértük (d). ∗𝑃<0,05 a CS csoporthoz képest.

A kolinhiány, bár javítja a glükóztoleranciát, súlyosbítja a zsírmájat, amit a szövettani elemzés és a máj trigliceridtömegének növekedése is alátámaszt (4. ábra (a)). A kolinhiány okozta májzsírosodás hátterében álló mechanizmusok megértése érdekében megvizsgáltuk a zsírsavak β-oxidációjában és a lipogenezisben részt vevő enzimeket. A kolinhiány növelte a hepatikus glicerin-3-foszfo-acil-transzferáz (GPAT) aktivitását (4(b) ábra) és csökkentette a β-hidroxi-acil-CoA-dehidrogenáz (β-HAD) (4(c) ábra), a zsírsavak β-oxidációjának kulcsenzimje aktivitását, ami arra utal, hogy több intracelluláris zsírsavat irányítottak lipid-bioszintézisbe az oxidáció helyett. Ezt az elképzelést tovább erősítette a máj foszfo-AMPK és foszfo-ACC expressziójának csökkenése (4. ábra (d)), ami aztán aktiválja az ACC-t és fokozza a máj lipogenezist.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

4. ábra

A zsírmáj kialakulásában szerepet játszó molekuláris mechanizmusok ob/ob egerekben kolinnal-hiányos étrenden. A 8 hetes hím ob/ob egerek 2 hónapig szabadon hozzáférhettek a CD vagy CS étrendhez. A májmetszeteket H & E festési protokollal festettük, és megmértük a máj triglicerid mennyiségét (a). Megvizsgáltuk a glicerin-3-foszfát-aciltranszferáz (GPAT) (b) és a β-hidroxil-acil-CoA-dehidrogenáz (β-HAD) (c) aktivitását. A foszfo-AMPK és a foszfo-ACC fehérjeexpresszióját követtük nyomon (d). ∗𝑃<0,05 a CS csoporthoz képest.

4. Megbeszélés

Egy korábbi munkánkban kimutattuk, hogy a kolin pótlása összefügg a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízással és inzulinrezisztenciával PEMT-hiányos egerekben . Nemrégiben megállapítottuk, hogy a kolin által kiváltott inzulinrezisztencia kolin-specifikus, nemcsak vad típusú egerekben, hanem PEMT-hiányos egerekben is (Wu és Vance et al. publikálatlan adatok). A jelenlegi vizsgálatban a kolinmegvonás hatását vizsgáltuk ob/ob egereken. A kolinhiány öt újszerű hatását mutattuk ki: (1) fokozott zsírzsír-lipolitikus aktivitás; (2) javult glükóz-oxidáció; (3) csökkent májzsírsav-oxidáció; (4) downregulált máj-glükagon-receptor-expresszió; (5) csökkent máj-mitokondriális komplex II aktivitás.

4.1. A kolinhiány mérsékli a testsúlygyarapodást

A kolinhiány jelentősen mérsékli a magas zsírtartalmú étrenddel indukált elhízást Pemt-/- egerekben és a testsúlygyarapodást ob/ob egerekben. Raubenheimer és munkatársai azonban arról számoltak be, hogy a kolinhiány nem befolyásolta a súlygyarapodást vagy a zsírszövet súlyát . A két vizsgálat közötti különbség az állatmodellek és a takarmányozási protokollok eltéréseiből adódhat. Raubenheimer vizsgálatában a C57Bl/6 egereket 8 héten át zsírdús vagy zsírszegény étrenddel etették, de az egerek csak az utolsó 4 hétben kaptak CD vagy CS étrendet. A mi ob/ob egereinket 8 héten keresztül a magas zsírtartalmú CD vagy CS étrenddel etették. Az irodalomban mind a hím, mind a nőstény ob/ob egereket széles körben használták anyagcsere-vizsgálatokban, például a testtömeg-gyarapodás és a máj (és az izom) inzulinérzékenység vizsgálatában, és nem számoltak be jelentős nemi hatásról. Vizsgálatunkban csak hím ob/ob egereket használtunk.

Jelen vizsgálatunk azt mutatja, hogy a kolin a genetikai eredetű elhízást is képes modulálni. Mivel a kolinhiány nem befolyásolta a táplálékfogyasztást, a fokozott zsírzsír-lipolitikus aktivitás (az aktív hormonérzékeny lipáz fokozott expressziója) magyarázhatja a csökkent zsírtömeget és a testsúlygyarapodást. Emellett nem zárhatjuk ki annak lehetőségét sem, hogy a kolinhiány fokozhatja az energiafelhasználást vagy az UCP1 expresszióját a barna zsírszövetben és az UCP2/UCP3 expresszióját a vázizomzatban, amelyek potenciális tényezők, amelyek hozzájárulhatnak a testtömeg-gyarapodás csökkenéséhez .

4.2. A kolinhiány javítja a glükóztoleranciát

A kolinpótlással ellentétben, amely egerekben a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott inzulinrezisztenciához kapcsolódik , a kolinhiány javította a glükóztoleranciát ob/ob egerekben. Ez összhangban van Raubenheimer vizsgálatával, ahol a magas zsírtartalmú CD diétán tartott C57Bl/6 egereknél csökkent az inzulinszint és javult a glükóztolerancia a kolinnal kiegészített magas zsírtartalmú diétához képest . A magas plazma glükagon általában 2-es típusú cukorbetegeknél található . A kolininjekció mind a plazma inzulin-, mind a glükagonszintet megnövelte patkányokban . Ezzel szemben vizsgálatunkban a kolinhiány csökkentette a plazma glukagonszintjét és a glukagonreceptor expresszióját. Mivel az utóbbi években a glukagonreceptor-antagonistákat javasolták a 2-es típusú cukorbetegség potenciális terápiás gyógyszereiként , így a glukagonreceptor csökkent fehérjeexpressziója a kolinhiányos étrenden lévő ob/ob egerekben bizonyos mértékig magyarázhatja a glükóztolerancia javulását. A csökkent hepatikus PGC-1α expresszió a PEPCK és a PDK4 downregulációjával járt együtt, ami csökkent glükózkibocsátásra és fokozott glükózoxidációra utal. A β-HADH-aktivitás alulregulációja csökkent zsírsav-oxidációra utalt. Ezeket a folyamatokat csökkent mitokondriális komplex II aktivitás kísérte, ami a csökkent mitokondriális oxidatív stresszre adott kompenzációs választ tükrözheti. Így a CD által javított glükóztolerancia a csökkent hepatikus glükózkibocsátásnak és a fokozott glükózhasznosításnak volt köszönhető. Ez a máj glükagonreceptorának szuppresszióján keresztül történhetett, amely az adenilát-ciklázon keresztül szabályozza az AMPK-t, ezáltal modulálva a PGC-1α-t és downstream célpontjait, például a PEPCK-t és a PDK4-et, valamint a máj mitokondriális elektrontranszportkapacitását. Így további vizsgálatokra van szükség annak bizonyítására, hogy a glükagon receptor a cukorbetegség új terápiás célpontja lehet.

4.3. A zsíros máj és az inzulinrezisztencia közötti összefüggés

A zsíros máj a 2-es típusú cukorbetegség elhízástól független előrejelzőjének bizonyult. A megnövekedett intracelluláris zsírsavak feltehetően ok-okozati szerepet játszanak a máj inzulinrezisztenciájában . A jelenlegi vizsgálatban a kolinhiány súlyosbította a zsírmájat, amelyben a β-hidroxi-acil-CoA-dehidrogenáz aktivitás csökkenését és a glicerin-palmitoil-aciltranszferáz aktivitás növekedését figyelték meg, ami a kolin zsírsav-metabolizmust moduláló szerepére utal. Ennélfogva a zsírsavak átirányítása a máj trigliceridraktárakba lehet egy kezdeti védőmechanizmus a máj intracelluláris zsírsavkoncentrációjának csökkentésére. A hosszú távú kolinhiány azonban hepatosteatózissal, a neurális csődefektus kockázatával, valamint a rák kockázatával és memóriavesztéssel függ össze , ami korlátozhatja a kolinhiányos étrend alkalmazását az elhízás és az inzulinrezisztencia hosszú távú terápiás stratégiájaként.

Végeredményben a kolinhiány megakadályozhatja a testsúlygyarapodást és javíthatja a glükóztoleranciát ob/ob egerekben. A magas kolintartalmú élelmiszerek bevitelének mérsékelt korlátozása előnyös lehet az elhízott, prediabéteszes és diabéteszes betegek számára. Eredményeink új lehetséges terápiás megközelítésekre utalnak.

Rövidítések

PC:	Foszfatidil-kolin
PEMT:	Foszfatidil-etanolamin N-metiltranszferáz
CD:	Kolinhiányos
CS:	Kolinpótlás
HSL:	Hormonérzékeny lipáz
PEPCK:	Foszfoenolpiruvát-karboxikináz
ACC:	Acetil-CoA-karboxiláz
AMPK:	AMP-aktivált protein kináz (AMPK)
PDK4:	Piruvát-dehidrogenáz kináz izoenzim 4
SOCS3:	Suppressor of cytokine signaling 3
GPAT:	Glicerin-3-foszfo-aciltranszferáz.

A szerzők hozzájárulása

G. Wu és L. Zhang egyenlő mértékben járultak hozzá.

Author Disclosure

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Acknowledgments

Ezt a munkát a Canadian Institutes of Health Research (MOP 89793) ösztöndíja támogatta.