A membrán adenil-cikláz szerkezete egy aktivált stimuláló G fehérjéhez kötődve

A membrán-integrális adenil-ciklázok (AC-k) kulcsfontosságú fehérjék az emlősök jelátvitelében, számos extracelluláris és intracelluláris jelre reagálnak, és ciklikus adenozin-monofoszfátot (cAMP) termelnek számos downstream jelátviteli eseményhez (1, 2). A membrán AC-k több jelátviteli kaszkádot integrálnak – például összekapcsolják a G-proteinhez kapcsolt receptorok (GPCR-ek) bemeneteit, az intracelluláris Ca2+ koncentráció változásait (3) és a lipid jelátviteli kaszkádokat (4). Az emlősökben kilenc AC altípus létezik, amelyeket AC1-től AC9-ig osztályoznak (5). Az aminosav-szekvencia alapján az összes AC-altípusnak ugyanaz az általános előrejelzett architektúrája. Ezek polytopikus membránfehérjék, amelyek 12 transzmembrán (TM) hélixből állnak, és citoszolikus N- és C-terminusokkal rendelkeznek. Az AC-polipeptid első hat TM-doménjét (TM1-TM6) egy citoszolikus régió követi, amely egy katalitikus domént (C1a), majd egy C1b domént, a második TM-régiót, a TM7-TM12 köteget, majd egy második katalitikus domént (C2a) és egy C-terminális C2b domént tartalmaz. A fehérjék N- és C-terminális részei igen változatosak, míg a leginkább konzervált részek a C1a és C2a domének, amelyek a III. osztályú nukleotidil-ciklázokhoz tartoznak (5, 6). Egy kiméra AC5C1/AC2C2 és a Gαs stimuláló G fehérje alegységgel alkotott komplexben lévő kiméra AC5C1/AC2C2 röntgenkrisztallográfiája (7, 8) feltárta az AC katalitikus gépezetének legfontosabb jellemzőit, és segített a G fehérjefüggő AC-k által történő cAMP-termelés részletes mechanizmusának megfogalmazásában (7, 8). Azonban az emlősök membrán AC-k mindegyike további szerkezeti elemeket tartalmaz, mint például a membránt átívelő domén és a helikális domén (HD), amelyek kritikusak e fehérjék helyes összeállításához és enzimatikus működésükhöz.

Az első emlős AC klónozásával jött az a felvetés, hogy az AC-k hasonlíthatnak a transzporterekhez (9). A Parameciumban található AC-k korai vizsgálatai azt sugallták, hogy a fehérje TM része ioncsatorna funkciót tölthet be (10). A csatorna funkcióval összhangban a Paramecium AC TM részének szekvenciája homológ a feszültségkapcsolt káliumcsatornákéval (11). A polytopikus TM hélixköteg és a citoszolikus adenozin-5′-trifoszfát (ATP)-kötő domén jelenléte az ATP-kötő kazettás (ABC) transzporterekkel való felszíni szerkezeti és funkcionális hasonlóságra utal. Az AC-k és az ismert transzporter-szerű vagy ioncsatorna-szerű fehérjék között azonban nincs jelentős szekvencia-hasonlóság. A mikobakteriális és emlős AC-ken végzett vizsgálatok a TM-domének lehetséges szerepére utaltak az enzim helyes összeszerelésében (7, 12, 13). A TM régió szerkezeti és funkcionális szerepe azonban továbbra is tisztázatlan.

Az

AC9 egy cikláz altípus, amely számos szövetben, többek között a tüdőben, az agyban és a szívben expresszálódik (14, 15). Kiterjedten tanulmányozták az A-kináz lehorgonyzó fehérje (AKAP) komplexekkel együtt (16). Azt javasolták, hogy az AC9 az AKAP Yotiao révén kapcsolódik az IKs káliumcsatornákhoz, a protein kináz A-hoz, a PDE4D3 foszfodiészterázhoz és a PP1 fehérjefoszfatázhoz (17). Az AC9-et az asztma potenciális gyógyszercélpontjaként azonosították (5). rs2230739, az AC9 Ile772→Met mutációt eredményező polimorfizmusa az inhalációs kortikoszteroid budesonidra adott válasz változásával hozható összefüggésbe (18). Az AC aktiválásának kanonikus modelljében a forskolin a katalitikus hely melletti alloszterikus helyhez kötődik, ami az enzim aktiválásához vezet. Az AC és a Gαs alegység közötti kölcsönhatás guanozin-5′-trifoszfát (GTP) kötött állapotban szintén AC-aktivációhoz vezet, és az AC maximális aktivációja a forskolin és a Gαs fehérje jelenlétében érhető el. Bár azonban a szekvencia-összehasonlítások más AC-kkel azt mutatják, hogy az AC9 tartalmaz egy allosztérikus helyet, és egy korábbi jelentés szerint a forskolin képes aktiválni az AC9-et (14), számos vizsgálat arra a következtetésre jutott, hogy az AC9 forskolin-érzetlen, és a szakterületen az a konszenzus alakult ki, hogy az AC9 forskolin-érzékeny fehérjeként saját kategóriájában áll (19, 20).

Az AC-k sokáig hiányzó darab maradtak a szignáltranszdukció megértésében, valószínűleg azért, mert elismert nehézségek merültek fel e fehérjék biokémiai és szerkezeti vizsgálatokhoz történő expresszálásában és tisztításában (21). Ennek a hiányosságnak a pótlására meghatároztuk a szarvasmarha AC9 szerkezetét Gαs-szal komplexben (AC9-Gαs) krio-elektronmikroszkópia (krio-EM) és egyrészecske-elemzés segítségével.

Expresszáltuk és tisztítottuk a szarvasmarha AC9-et (S1A ábra), és cAMP-akkumulációs vizsgálatokkal igazoltuk funkcionális integritását (1. ábra, A-C). A tisztított fehérje katalizálta az ATP cAMP-pá történő átalakítását, és gátolható volt MANT-GTP-vel (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-metilanthraniloil)guanozin-5ʹ-O-trifoszfát), egy gátló AC-szubsztrátanalóggal (1B. ábra). A fehérje rekonstitúciója a GTPγS-aktivált Gαs (S1 ábra, B és C) a cikláz erőteljes aktiválódásához vezetett (1A ábra). Az univerzális AC-aktivátor forskolin in vitro AC9 aktiváló képességének vizsgálata az AC9 nagyon gyenge aktiválását mutatta szubmillimoláris koncentrációkban (1A. ábra). Ezzel szemben a forskolin az AC9-Gαs komplexet 111 μM medián effektív koncentrációval (EC50) tudta aktiválni (1A. ábra és S2. táblázat). Így, bár mind a forskolin, mind a Gαs alegység képes volt a fehérje részleges aktiválására, teljes aktiválást csak a két szer kombinációjával lehetett elérni. Ráadásul, ahogy az az AC allosztérikus modulátorától várható, a forskolin az AC9 szubsztrátanalóg MANT-GTP medián gátló koncentrációját (IC50) az alacsonyabb koncentráció felé tolta el (1. ábra, B és C). Ezért a tisztított teljes hosszúságú AC9 és Gαs fehérjével végzett in vitro kísérleteink egyértelműen azt mutatják, hogy a forskolin klasszikus alloszterikus aktivátorként hat az AC9-Gαs fehérje komplexre.

Fagyasztott, hidratált krio-EM rácsokat készítettünk, amelyek az AC9-Gαs komplexet MANT-GTP és forskolin jelenlétében olyan koncentrációban (0,5 mM mindkét ligandum esetében) tartalmazzák, amely meghaladja a két vegyület IC50 és EC50 értékét, majd egyrészecske-krio-EM elemzésnek vetettük alá őket (S2 ábra). A részecskék legjobb részhalmaza a cikláz és a G-fehérje alegység teljes komplexének megfelelő sűrűségtérképet eredményezett, 3,4 Å felbontásra finomítva (1D ábra). A teljes sűrűségtérkép a komplex membránba ágyazott (S3. ábra) és citoszolikus (S3. ábra) részeinek fókuszált finomítása után kapott térképekkel együtt lehetővé tette az AC9-Gαs komplex teljes háromdimenziós (3D) modelljének felépítését (1E. ábra). A térkép és a modell feltárta az AC9-Gαs komplex több kulcsfontosságú elemét: (i) az AC9 12-TM doménkötegét, (ii) a TM-köteget és az AC9 katalitikus doménjét összekötő HD-t, valamint (iii) az AC9 katalitikus doménjét a GTPγS-aktivált Gαs alegységhez kötve (ábra. 1. ábra, D és E, valamint S6. ábra).

A fehérje TM-doménje pszeudo-kétszeres szimmetriával rendelkezik, ami gyakran megtalálható a rezisztenciális nodulációs osztódás, ABC vagy major facilitátor családba tartozó oldottanyag-transzportereknél (2. ábra, A-C). A TM1-TM6 és TM7-TM12 transzmembrán hélixek 176 maradékon keresztül 3,4 Å átlagos négyzetes eltéréssel (RMSD) szuperponálhatók (2D ábra). A belső pszeudoszimmetria alátámasztja azt a hipotézist, hogy az emlősök membrán AC-i egy egyszerű rendszerből, valószínűleg a Mycobacterium tuberculosisból származó Cya/Rv1625c “félciklázhoz” hasonló génduplikációs esemény révén keletkeztek (12). Az AC9 két TM fele közötti határfelületet a TM-doménköteg N-terminális “felében” a TM1, TM4 és TM6 hélixek, a fehérje C-terminális részében pedig a TM7, TM10 és TM12 hélixek alkotják (2. ábra, B és C). Az első emlős AC gén klónozását az a felvetés kísérte, hogy az AC-k elsődleges szekvenciájuk alapján transzporterként működhetnek (9). Szerkezetünk nem mutat semmilyen nyilvánvaló feltételezett oldott anyag transzlokációs útvonalat a TM-domén kötegén belül, az AC9 TM-hélixei szorosan egymás mellé vannak pakolva. Bár a digitonin-micella valószínűleg a lipid kettősréteghez hasonló környezetet biztosít, lehetséges, hogy a TM-hélixek konformációja a membrán fiziológiás környezetében eltérő.

Az AC9 TM6 és TM12 hélixei a citoszolba nyúlnak, 40 residuum hosszú HD-ket alkotva, amelyeket itt HD1 (beleértve a h1.1 és h2.1 hélixeket) és HD2 (h2.1 és h2.2 hélixek; 2. ábra, E és F) néven említünk. Ez a régió fontos az AC-k és a guanil-ciklázok működésében prokariótákban és eukariótákban (12). A h1.1 spirál Leu323-tól Met333-ig és a h2.1 spirál Ile1022-től Leu1032-ig terjedő rezidensei klasszikus tekercset alkotnak (2F ábra). Korábban leírtuk a Cya, a Mycobacterium intracellulare membrán AC-jének HD-jét, amely homológ az M. tuberculosis Rv1625c-vel (12). Az AC9 HD a Cya-hoz képest némi eltérést mutat a katalitikus doménnel határos magterület relatív elrendezésében (2. ábra, E és F, valamint S7. ábra, A és B). A M. intracellulare Cya-ban a rövid hélixek szorosan kötődnek a tekercs C terminusához (S7B ábra). Ezzel szemben az AC9 tekercselt tekercse a h1.1 és h2.1 C-terminális végénél feloldódik (2F ábra, S7B ábra és S8A ábra). Az enzimnek ez a régiója kritikus az AC-k és a guanil-ciklázok működéséhez. A genetikai betegséggel összefüggő mutációk a familiáris diszkinéziában és az arcmimózában (22, 23) az AC5, a Leber-féle veleszületett amaurozis-1-ben (24) és a kúp-pálcika-disztrófia-6-ban (CORD6) (25) pedig a retinális guanil-cikláz (retGC1) HD-jeihez kapcsolódnak. A betegséggel összefüggő mutációk pozícióit most pontosítani tudjuk a szarvasmarha AC9 szerkezetének segítségével, amely a M. intracellulare Cya-hoz képest sokkal közelebb áll a humán patológiával összefüggő nukleotidil-ciklázokhoz.

A 12-TM köteg funkciója az emlős AC-kben eddig tisztázatlan volt. A közelmúltban a mikobakteriális Rv1625c-vel végzett vizsgálatok a mikobakteriális homológ membránon átívelő régiójának lehetséges receptorfunkciójára utaltak (12). Az AC9 extracelluláris felszínének egyes részeit nem tudtuk felbontani (2. ábra, A és B), és nem világos, hogy a fehérje membránhoz kötött része rejt-e funkcionálisan releváns kötőhelyeket a hipotetikus ligandumok számára. Hasonlóképpen, a C1b domén, amely a C1a katalitikus domént és a TM7-et köti össze, nem volt felbontható a rekonstrukciónkban (S6. ábra, E-G). Szerkezetünk azonban támpontokat ad arra vonatkozóan, hogy a membránt átívelő régióval való kölcsönhatások hogyan befolyásolhatják a fehérje katalitikus funkcióját. A TM6 és TM12 hélixek folyamatosak a h1.1 és h2.1 hélixekkel a HD-ban. A TM6 és TM12 a TM1-TM6 és TM7-TM12 helikális kötegek határfelületén helyezkedik el, és oldalirányban a lipid kettősrétegnek van kitéve (2E ábra és S8B ábra). Elképzelhető, hogy a TM6 vagy TM12 közvetlen kölcsönhatásai lipidekkel, kis molekulákkal vagy más fehérjékkel közvetlenül befolyásolhatják a katalitikus domént a h1.1 és h2.1 hélixek orientációjának megváltoztatásával (S8B ábra).

A teljes AC9 katalitikus domén két félből, C1a és C2a részből áll (1E és 3A ábrák), hasonlóan a membrán AC-k oldható doménjeinek korábban megoldott röntgenstruktúráihoz (S7 ábra, A és C). Amint azt korábban kimutattuk, a G fehérje α alegysége és az AC9 katalitikus doménje közötti fő kölcsönhatási felületet a Gαs Switch II hélixnek az AC9 C2a doménjének α′2 és α′3 hélixei által alkotott barázdába való beillesztése képezi (S7. ábra, D-F). A h1.2 HD régió (340-360 maradék) a Gαs-interakciós felület közelében helyezkedik el (S7E ábra). A fehérjének ez a régiója rendkívül dinamikusnak tűnik, és nem tudtuk felbontani az AC9 His361-et és Pro384-et összekötő maradékokat (S7E ábra). Mindazonáltal ennek a régiónak a G-fehérje-AC határfelülethez való közelsége arra utal, hogy az AC9 szerkezetének ez az eleme valószínűleg hozzájárul az AC9 és a Gαs közötti kölcsönhatáshoz.

Az ATP-kötőhelyen és a forskolin-helyen belül található erős sűrűségű elemet detektáltuk (3. ábra, A és B, valamint S9. ábra, A-C). Ez a sűrűség felületes hasonlóságot mutatott a MANT-GTP sűrűségével, de nem egyezett a várt helyével (3A ábra). Úgy tűnt, hogy a forskolin-hely sűrűsége átfedésben van a forskolin várható helyzetével (3A. ábra). Hasonló sűrűségi jellegzetesség volt jelen a forskolintól mentes minta képeiből rekonstruált térképen (3B ábra és S9B ábra). Ezért úgy tűnik, hogy a MANT-GTP és/vagy a forskolin jelenlététől függetlenül az aktív és alloszterikus helyeket egy peptidnek megfelelő sűrűség foglalja el (3. ábra, A és B, valamint S9. ábra, A és B). A fókuszált 3D osztályozás és finomítás feltárta a kapcsolatot e sűrűség és az AC9 C2a doménjének C-terminális régiója között (3C ábra és S3 és S9C ábra). Bár a sűrűségjellemzők ebben a kevésbé népes 3D osztályban (SOL-C térkép, mindössze 16 343 részecskével számolva) nem elég erősek ahhoz, hogy magabiztosan felépítsünk egy atomi fehérjemodellt, a rendelkezésre álló sűrűséget megkötésként használva az AC9 C-terminálisának Cys1246-tól Pro1275-ig terjedő maradékaihoz, vagyis a C2b-doménhez tudtuk rendelni (3C. ábra és S9C ábra). Az allosztérikus és az aktív centrumon belüli sűrűség jó minősége (3A. ábra és S9. ábra, A és D) lehetővé tette számunkra az AC9 C2b doménjének Ile1263-Pro1275 maradékaihoz tartozó okklúziós peptid modelljének megalkotását (S9D ábra). Ez a régió erősen konzervált a gerinces AC9 homológok között (S9E ábra), de a többi AC izoformában (AC1-től AC8-ig) nem (S10 ábra).

A C2b domén AC9-ben betöltött funkcionális szerepének meghatározásához összehasonlítottuk a vad típusú és a C2b doméntől mentes AC91250 csonka fehérje enzimatikus tulajdonságait (3D ábra és S11A ábra). A két konstrukció hasonló képességet mutatott az ATP cAMP-á történő átalakítására, hasonló Michaelis-állandóval (Km) és Vmax értékekkel (3E ábra és S2 táblázat). Az AC91250-et forskolin aktiválta és MANT-GTP gátolta az AC9-hez hasonló módon (S11 ábra, B-D). A Gαs hozzáadása erőteljesen serkentette az AC9 cAMP-termelését (3F ábra), és ezzel párhuzamosan nőtt az ATP-hez tartozó Km értéke. Az ATP-kötést gátló farokkal összhangban az AC91250 magas Vmax értéket mutatott, de sokkal alacsonyabb Km érték mellett (3F ábra). Ez határozottan arra utal, hogy a C2b régió funkcionális szerepet játszik az AC9 G-fehérjéhez kötött állapotában. A C2b régió eltávolítása növeli az AC9 ATP-hez való affinitását Gαs jelenlétében, lehetővé téve a fehérje számára, hogy sokkal alacsonyabb ATP-koncentráció mellett is elérje a maximális katalízissebességet. A szubsztrát (ATP) iránti affinitás csökkentése azáltal, hogy a C2b domén elzárja az aktív centrumot, a G-proteinhez kötött AC9 cAMP-termelésének szabályozására szolgáló szabályozó mechanizmust jelenthet.

Az AC9 okkludált állapotában bekövetkező konformációs változások értékeléséhez meghatároztuk az AC91250-Gαs komplex krio-EM szerkezetét MANT-GTP és forskolin jelenlétében (AC91250-Gαs-MF; 3. ábra, G és H, valamint S12 és S13 ábrák). A 4,2Å felbontású rekonstrukció lehetővé tette, hogy egyértelműen feloldjuk a kanonikus kötőhelyeikhez kötött MANT-GTP és forskolin sűrűségét (3. ábra, G és H, valamint 4. ábra; S13. ábra, E-G). Az AC91250-Gαs-MF és az AC9-Gas komplexek katalitikus domén elrendeződésének összehasonlítása a C1a kis relatív átrendeződését mutatta ki, amely az elzáró peptid jelenlététől függ az aktív és allosztérikus helyeken (ábra. 4, A és B); a két összehasonlított szerkezetben a C2a domének (Gln1049-Lys1245) segítségével igazított mobil C1a domének (Ile1380-Gln574) atomjai közötti RMSD 1,9 Å. Az AC9 okklúziós állapotában megfigyelt finom egész doménmozgás ~3 Å-val eltolja a C1a nukleotidkötésben részt vevő aminosavmaradványait (S13H ábra). Ezért az AC9 katalitikus magdoménje okkludált konformációt vesz fel, és a C2b-ból származó peptid elfoglalja a fehérje aktív és allosztérikus helyét (S9. ábra, D és E), ami az aktív hely torzulásával jár együtt a MANT-GTP- és forskolin-kötött állapotban megfigyelthez képest.

Az AC9-Gαs komplex okklúziós konformációban lévő szerkezete lehetővé tette számunkra, hogy felülvizsgáljuk a cAMP-alapú jelátvitel bevett modelljét (7, 26) (S14 ábra). A GPCR-kaszkád aktiválásának az AC Gαs alegységhez kötött formájának kialakulásához kell vezetnie a cAMP előállításához. Az itt leírt elzárt állapot azonban egy olyan köztes állapotot ad hozzá, amelyet korábban nem értékeltek. Az AC9 okkludált állapota és aktív állapota valószínűleg egyensúlyban létezik; az okkludált állapot rekonstrukcióját előidéző minta a G-fehérje által aktiválható és cAMP-ot termelhet. A fehérje jelentősen csökkent Km-értéke az ATP-hez (3F ábra) továbbá arra utal, hogy az ATP-hely elzáródása a G-fehérje jelenlétében előnyös lehet. A jövőbeli kísérletek segítenek meghatározni ennek a fehérje-konformációnak a funkcionális szerepét az AC9 katalitikus ciklusában.

Az AC9 ebben a tanulmányban feltárt architektúrája támpontokat ad a membránba ágyazott részek lehetséges szerepéhez az emlős AC-kben. A membrán domén egyik nyilvánvaló funkciója az aktív cikláz megfelelő összeszerelésének lehetővé tétele. Ez úgy valósul meg, hogy a TM6 és TM12 biztosítja a keretet a HD számára. Valószínű, hogy a fehérje jelenleg nem felbontható elemei, azaz az N-terminus és a C1b domén hozzájárulnak az AC9 cikláz funkciójának összeállításához és szabályozásához (S6. ábra, E-G). Ezért annak ellenére, hogy a katalitikus domén ~40 Å távolságra van a lipid kettősrétegtől, elképzelhető, hogy a fehérje membrán része a HD és a mellette lévő hurok régiókon keresztül képes befolyásolni a katalitikus domént.

A komplex okkludált állapota a C-terminális peptiddel, amely az AC9 aktív és allosztérikus helyét is megköti, fontos autoregulációs mechanizmust jelenthet, amely az AC-alapú jelátviteli gépezetbe van beépítve. A peptid jelenléte segíthet megmagyarázni az AC9 forskolin-érzékenységének ellentmondásos megfigyeléseit (14, 19, 20), ami az AC9 kontextusfüggő autoregulációját támasztja alá. A forskolin az AC-k növényi eredetű kismolekulás aktivátora; az AC-k e helyének természetes aktivátorát vagy inhibitorát posztulálták (20), de eddig nem sikerült azonosítani. Az AC9 esetében most megmutathatjuk, hogy (i) a forskolin képes aktiválni az enzimet, és (ii) az alloszterikus hely valószínű természetes szabályozója a C2b doménnek a fehérje aktív régiójához kötődő része. Azt feltételezzük, hogy a G-fehérje általi aktiválást követően (S14. ábra, A-D) a C2b elzárja az AC9 reakciócentrumot és blokkolja az enzimaktivitást, megakadályozva a cAMP túlzott termelődését a sejtben (S14E ábra). Ez összhangban van az AC9 C2b doménjének autoinhibitorikus funkciójáról szóló közelmúltbeli jelentéssel sejtes kontextusban (27). Eredményeink segíthetnek az AC9-Gαs szerkezet által feltárt autoregulációs molekuláris mechanizmust kihasználó új megközelítések létrehozásában a gyógyszerkutatásban.