Az eredetileg amplifikálni próbált DNS-töredékek közül, csak a tlp2, a che1P és a cheA1 (1. táblázat) termelt PCR-amplifikációs terméket oldószer-adalékanyagok használata nélkül, amikor az A. genomiális DNS-ét. brasilense DNS-ét használtuk templátként (1. ábra). Először az 1,25%-os, 2,5%-os, 5,0%-os, 7,5%-os és 10%-os (w/vol) DMSO, valamint a hasonló koncentrációjú formamid PCR-adalékanyagként való hatását vizsgáltuk (1. ábra). Egy PCR-sorozatot 1-10 μg/μl BSA-val is lefuttattunk (az adatok nem láthatóak). Az irodalmi adatokkal összhangban , míg mind a DMSO, mind a formamid hozzáadása a PCR-hez elősegítette a 2-3 kb-os DNS-fragmentumok amplifikációjának megnövekedett hozamát, a DMSO fokozó hatása nagyobb volt, mint a formamidé (1. ábra). Ilyen körülmények között azt is megfigyeltük, hogy a DMSO koncentrációjának növelése a PCR-specifikusság csökkenéséhez is vezethet (2. ábra). Másrészt a formamidnak a PCR-hozam növekedését elősegítő hatása csökkent a körülbelül 2,5 kb-nál nagyobb DNS-fragmentumok esetében (1. ábra). A BSA önmagában, mint PCR-adalékanyag hozzáadásának ilyen körülmények között nem volt jelentős hatása, beleértve a káros hatást sem (az adatok nem láthatóak). A BSA PCR-hozamot növelő hatását DMSO-val vagy formamiddal kombinálva a DNS-fragmentek méretének széles tartományában észleltük (2. ábra). Továbbá a BSA hozzáadása még a nagyobb méretű DNS-templátumok esetében is kiszélesítette azt a koncentrációtartományt, amelyhez a szerves oldószert hozzá lehetett adni (2. ábra). A formamiddal kapcsolatos jelenlegi szakirodalom konszenzusos véleménye szerint a PCR-adalékanyagként a leghatékonyabb, ha 0 és 5% közötti koncentrációban alkalmazzák, és a hatékonyság 10%-nál teljesen lecsökken. Eredményeink azt mutatják, hogy BSA jelenlétében a formamid legalább 10%-os koncentrációig és legfeljebb 2,5 kb méretű DNS-templátumok (tlp2) esetén hatékony; a nagyobb méretű DNS-fragmentumok amplifikációját azonban nem segítette elő (1. ábra). Ez az eredmény összhangban van a formamid jelentett hatásával, amely szerint a leghatékonyabb a DNS-templátumok amplifikációjánál körülbelül 2,5 kb-ig, és tovább erősíti azt az elképzelést, hogy a DMSO és a formamid különböző mechanizmus(ok) révén növelte a PCR-hozamot. Ezektől a különbségektől függetlenül úgy tűnt, hogy a BSA hozzáadása ehhez a PCR-hez tovább elősegíti és kiterjeszti a két oldószer bármelyikének PCR-adalékként való alkalmazásakor tapasztalt kedvező hatásokat. Tekintettel a magas szerves oldószer-koncentrációk lehetséges negatív hatásaira az olyan érzékeny downstream alkalmazásokra, mint a szekvenálás vagy a klónozás, a BSA hozzáadásának fokozó hatása jelentős. Annak érdekében, hogy betekintést nyerjünk abba, hogy a BSA hogyan működhet DMSO-val vagy formamiddal együttesen erősítőként, elemezzük a hozzáadásának hatását az amplifikációs hozamra 10, 15, 20, 25 és 30 PCR-cikluson keresztül. Ez az elemzés megerősítette, hogy a DMSO vagy formamid, de nem a BSA önmagában történő hozzáadása a PCR-hez a hozam növekedéséhez vezet (3. ábra). Amikor a BSA-t DMSO-val vagy formamiddal együtt használtuk, a hozamnövekedés csak az első 15 ciklusban volt kimutatható minden templát esetében (3. ábra). Ez a növekedés a hozam 10,5%-os (che1P) és 22,7%-os (cheA1) növekedése között mozgott az első 15 ciklus során. Továbbá a BSA hatékony koncentrációja a felerősített DNS-fragmentum méretével együtt nőtt a maximális BSA-koncentrációig (10 μg/μl), ahol már nem volt kimutatható további hozamnövekedés. Ezen túlmenően, még a legnagyobb BSA-koncentráció hozzáadásakor sem volt megfigyelhető a hozam csökkenése ilyen körülmények között (4. ábra). A BSA cikluskorlátozott, a PCR-hozamot növelő hatása arra utalt, hogy ez a fehérje idővel denaturálódhat, és ezáltal elveszítheti hatékonyságát. E hipotézis tesztelésére olyan PCR-t állítottunk fel, amelyben a DMSO-t vagy formamidot a BSA-val kombináltuk a kezdeti reakciópufferben a fent meghatározott leghatékonyabb koncentrációban, és 10 cikluson keresztül futtattuk, mielőtt friss BSA-oldatot adtunk volna hozzá (0-10 μg/μl végső koncentráció). A BSA hozzáadását 30 PCR-cikluson keresztül megismételtük, és a hozamra gyakorolt hatást a fent leírtak szerint elemeztük. Tartós hozamnövekedést lehetett kimutatni, amikor a BSA-t minden tizedik PCR-ciklusnál hozzáadtuk: például a cheA1 amplifikációja során a PCR-hozam közel 75%-os növekedést értünk el a csak oldószerrel kapotthoz képest (4. ábra). Az általunk “BSA PCR-lépésnek” nevezett módszerben tapasztalt eredmények összhangban vannak azzal a feltételezéssel, hogy a BSA denaturációja okozza a hozamnövelő hatás csökkenését a PCR tizenötödik ciklusa után. Az olyan kontrollkísérletek, amelyekben minden tizedik ciklusban glicerint vagy desztillált steril vizet adtunk hozzá, nem növelték a PCR-hozamot, ami azt jelzi, hogy a BSA hatása nem a reakciótérfogat változásának vagy annak köszönhető, hogy a BSA hatékonyan molekuláris zsugorítóként működik, amely tulajdonságot a glicerin egyes hatásainak tulajdonítanak a PCR-ben. Bár a BSA PCR-hozamot növelő hatásának pontos mechanizmusa nem ismert, az itt kapott és az irodalomban leírt adatok alátámasztják azt a hipotézist, hogy a BSA stabilizálhatja a DNS-polimerázt és/vagy ellensúlyozhatja a magas koncentrációjú szerves oldószerek DNS-polimeráz-aktivitásra gyakorolt esetleges gátló hatását. A cheA4, az ebben a vizsgálatban használt legmagasabb GC-tartalmú (73%) DNS-fragmentum amplifikációjánál a PCR-hozam növekedését kaptuk a BSA, valamint a DMSO hozzáadásával a PCR-hez, de több nem specifikus amplifikációs terméket is kimutattunk (5. ábra). E probléma megoldása érdekében a BSA PCR-lépéses módszert ezután a “Touchdown” PCR protokollal kombinálva alkalmaztuk, amelyről korábban kimutatták, hogy javítja a PCR specificitását . Ez a módszer egyetlen specifikus sávot eredményezett, és majdnem megduplázta a “Touchdown” protokoll és a szerves oldószerek kizárólagos használatával kapott hozamot (96%-os növekedés) (5. ábra). Ezek az eredmények azt is felvetették számunkra, hogy hogyan lehet javítani a QuickChange Stratagene Mutagenesis Kitben (Stratagene) leírt teljes plazmid hely-irányított mutagenezis módszer viszonylag alacsony hatékonyságát, hogy mutációt vezessünk be néhány GC-gazdag DNS-templátba (itt a tlp2 gén, egy 2,5 kb-os, 66% GC-t tartalmazó fragmentum). Amikor a pUCtlp2-t használtuk templátként a helyirányított mutagenezishez, a tlp2-n belüli egyetlen bázispár szubsztitúció bevezetésére tervezett mutagén primerekkel (a gyártó honlapja szerint tervezett mutagén primerek) és a gyártó protokolljával együtt, a pUCtlp2-nek megfelelő 5,324 kb-os fragmentum alig volt látható (5. ábra). A mutagenezis protokolljának a gyártó utasításai szerinti elvégzése után vagy nem kaptunk kolóniát, vagy kis számú (átlagosan 5-nél kevesebb) olyan kolóniát, amelyek a kívánt mutációt nem tartalmazó szülői plazmidot tartalmaztak. Az ilyen típusú eredményt, amelyet a mutagenezis gyenge hozama jellemez, korábban e módszer gyakori buktatójaként ismerték el . Amikor azonban minden ötödik lépésben BSA-t adtunk a gyártói pufferhez, egyértelműen amplifikációs terméket detektáltunk (5. ábra). A gyártó protokolljának végrehajtása után több mint 100 olyan kolóniát kaptunk, amelyek 2/3-a hordozta a kívánt mutációt (szekvenálással meghatározva). A BSA PCR lépést egy overlap extension protokollban is alkalmaztuk, hogy egy A. brasilense gén (ATM, 650 bp) és a cian fluoreszcens fehérje (CFP) (720 bp) közötti kiméra fehérjefúziót hozzunk létre. Az overlap extension PCR során először 2 primerpár-készletet használunk két fuzionálandó DNS-fragmentum amplifikálására, amelyek rövid, egymással átfedő szekvenciával keletkeznek. Egy harmadik amplifikáció az első reakciók amplifikációs termékeit használja sablonként, a legkülső reverz és forward primerekkel együtt, hogy kiméra konstrukciókat hozzon létre . A kezdeti két DNS-töredék, az ATM és a CFP amplifikációja nagyon hatékony volt a standard PCR protokollok használatával, és a BSA PCR Step protokoll használatával nem lehetett jelentős növekedést elérni (az adatok nem láthatóak). A második, átfedő PCR lépés azonban számos nem specifikus amplifikációs terméket és kevés, vagy egyáltalán nem kívánt kimérai amplikont (ATM-CFP; 1. táblázat) eredményezett (5. ábra). A nem specifikus amplifikációs termékek eltűntek, amikor a “Touchdown” PCR-módszert alkalmaztuk, de a specifikus, kívánt kimérai amplikon nagyon kis mennyiségben maradt, amit egy nagyon halvány, 1370 bp ATM-CFP sáv mutatott ki (5. ábra). A BSA PCR Step módszer és a “Touchdown” protokoll együttes alkalmazása 72%-os növekedést eredményezett az ATM-CFP kimérikus amplikon hozamában (5. ábra). Az ezt követő klónozás és szekvenálás megerősítette, hogy a megfelelő kiméra konstrukciót kaptuk.
DMSO és formamid hatása a GC-gazdag templátok PCR-amplifikációjára. Jellemző példák a különböző koncentrációjú DMSO és formamid hozzáadásának hatásaira 2-3 kb GC-gazdag DNS-templátumok PCR-amplifikációjára. A) A DMSO hatása a che1P (fent) és a tlp2 (lent) PCR-amplifikációjára a teljes PCR-termékek gélelektroforézisével megfigyelve. A géleket etídium-bromiddal festettük és fényképeztük. B) Formamid hatása a che1P (fent) és a tlp2 (lent) PCR-amplifikációjára hasonló kísérletekben.
A szerves oldószerekkel együtt alkalmazott BSA PCR-hozamnövelő hatása. Jellemző példák a DMSO-val és formamiddal együtt adalékként használt BSA különböző koncentrációjú hatásaira a GC-gazdag DNS-templátumok PCR-amplifikációjára. A) A DMSO hatása a che1P PCR-re (balra) és a DMSO és 6 μg/μl BSA együttes hatása (jobbra), amint azt a teljes PCR-termék gélelektroforézisével megfigyelték. B) Formamid hatása a che1P PCR-amplifikációjára (balra) és a formamid és 6 μg/μl BSA együttes hatása (jobbra) összehasonlítható kísérletekben.
A BSA szerves oldószerekkel való együttes adagolásának hatása a PCR-hozamra. A PCR-hozam növekedését az adalékanyag nélkül kapott PCR-hozamhoz viszonyítva fejeztük ki. Minden panelen a következő legenda szerepel: piros vonal, csak DMSO (7,5%); zöld vonal, csak formamid (2,5%); lila vonal, DMSO (7,5%) és BSA (6 μg/μl); világoskék, formamid (2,5%) és BSA (6 μg/μl). A) che1P PCR-amplifikációja (392 bp); B) tlp5P PCR-amplifikációja (798 bp); C) tlp2 PCR-amplifikációja (2638 bp); D) cheA1 PCR-amplifikációja (3389 bp); E) cheOP1 PCR-amplifikációja (7103 bp).
A BSA mint szerves oldószerekkel együtt adalékanyag hatása, ha a PCR köztes lépéseinél kiegészítik. A) A BSA hozzáadásának hatása a PCR-hozamra, ha tízciklusonként adjuk hozzá a széles mérettartományba eső (392 bp és 7103 bp közötti) DNS-fragmentumok esetében; B) Reprezentatív példa a BSA hozzáadásának hatására a cheA1 (3389 bp) PCR-amplifikációjára DMSO jelenlétében, amint azt a gélelektroforézissel amplifikált DNS-fragmentumok elemzése kimutatta.
A BSA mint szerves oldószerekkel való társadalék hatása különböző PCR-alkalmazásokban. A) Reprezentatív példa a BSA-adalék (BSA Step) mint a DMSO-hatás társerősítőjének a cheA4 PCR-amplifikációra gyakorolt hatására egy “Touchdown” PCR-protokollban, amint azt gélelektroforézissel kimutatták. B) Reprezentatív példa a BSA Step protokoll hatására, amelyet a pUCtlp2 hely-irányított mutagenezis (QuickChange hely-irányított mutagenezis, Stratagene) PCR-amplifikációjában használtak, gélelektroforézissel detektálva. C) Reprezentatív példa a BSA Step protokoll hatására, amelyet az ATM és a CFP fúziójának ATM-CFP előállításához használtak overlap extension PCR alkalmazásban, amint azt gélelektroforézissel kimutatták.