A tengeri sün állati pólus doménje egy Six3-függő neurogén mintázó központ | Fejlődés

Eredmények

A jelölt állati pólus domén (APD) szabályozó génjeinek azonosítása

Az APD korai szabályozási állapotának meghatározásához a tengeri sün embrióban egyszerre használtunk bioinformatikai és kísérleti megközelítéseket, hogy azonosítsuk a gasztruláció előtt a thisterritoryban kifejeződő szabályozó fehérjéket kódoló géneket. A bioinformatikai megközelítés a laboratóriumunk (Burke et al., 2006) és mások (Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Materna et al., 2006; Tu et al., 2006) genomszekvencia-annotációs erőfeszítéseit használta fel, amelyek számos olyan gén APD-expressziós mintázatát dokumentálták, amelyek transzkripciós faktorokat kódoltak és/vagy más fajok embrióiban az idegszövetben ismert faktorok ortológjai voltak. A kísérleti megközelítés összehasonlította az RNS-ek reprezentációját Δcadherin mRNS-injektált és normál embriókban a kikelő blasztula stádiumban. A nukleárisβ-katenint nélkülöző embriók szinte kizárólag az állati pólus ektoderma állományából állnak, amint azt a foxq2 és a hbn expressziós mintázata is mutatja. Normális embriókban ezek az mRNS-ek a blastula stádiumban kezdődően az állati pólusra korlátozódnak(Burke et al., 2006;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008), és expressziós területeik a mesenchyma blastula stádiumban átfedik az állati póluson (1B-D ábra). A gasztruláció során a fejlődés előrehaladtával azhbn-expresszáló sejtek doménje egy gyűrűt alkot, amely körülveszi afoxq2-t expresszáló sejteket (1F ábra). Amikor a kanonikus Wnt, Nodal és BMP jelátvitelt ΔcadherinmRNS injekcióval megszüntetjük, az embrió állati fele foxq2-t expresszál, míg az embrió fennmaradó részének nagy része hbn-t expresszál (1H ábra). Ezek a minták azt jelzik, hogy a kanonikus Wnt és Nodal-BMP2/4 jelátvitelt nélkülöző embriók szinte teljes egészében egy drámaian kiterjesztett APD-ből állnak, amelynek külső határait a hbn expresszió határozza meg. A Foxq2 és a hbn transzkriptek a késői hasadási/korai blasztula stádiumban jelennek meg az APD-ben, ami azt jelzi, hogy az APD specifikációja legalább ekkorra megtörténik.

A korai APD szabályozó gének azonosításához összehasonlítottuk az egyes mRNS-ek relatív koncentrációját a Δcadherin mRNS-sel és a glicerinnel injektált embriókban a kikelő blastula stádiumban egy olyan microarray segítségével, amely a tengeri sün genomszekvenciájában található összes génpredikciót reprezentálja(Wei et al., 2006). Ez a szakasz a hasadás és a morfogenezis kezdete közötti átmenetet jelzi, és röviddel az APD legkorábbi markereinek észlelése után következik be (Burke és mtsai., 2006;Howard-Ashby és mtsai., 2006a;Howard-Ashby és mtsai., 2006b;Tu és mtsai., 2006;Yaguchi és mtsai., 2008). Azonosítottunk egy transzkripciós faktorokat és jelátviteli útvonalak komponenseit kódoló génkészletet, amelyek átlagosan legalább 3-szor magasabb expressziót mutattak aΔkadherin mRNS-t tartalmazó embriók két tételében. Ezek részben fedték a bioinformatikai megközelítéssel azonosított jelölt gének halmazát. Az egyesített halmazok 27 gént tartalmaznak, és alkotják az ideiglenes APD szabályozó génkészletet (E-APD) (1. táblázat).

Az E-APD készleten belül a legkorábban kifejeződő gének azonosítása érdekében megvizsgáltuk a microarray-vel generált időbeli expressziós profilokat a korábban leírtak szerint (Wei et al., A mintázatokat a publikált adatokkal való összehasonlítással (Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) és a mi whole-mount in situ hibridizációinkkal (nem publikált megfigyeléseink) ellenőriztük.) A géneket három csoportba soroltuk: az anyai RNS-populációban maximálisan reprezentáltak (2A ábra), a hasadási szakaszokban erősen felszabályozottak (2B,C ábra) és a késői hasadási és a korai gasztrula szakaszok között felszabályozottak (2D ábra). Először a korai embrionális expressziós csoport tagjaira összpontosítottunk. Amint alább látható, mind a loss-, mind a gain-of-function próbák segítségével azonosítottunk egyet, az Sp-Six3-at (a továbbiakban Six3), amely az APD generációs szabályozó hierarchia csúcsán vagy annak közelében működik.

A Six3 az APD korai szakaszában fejeződik ki

A tengeri sün Six3 azonosítása egyértelmű, mivel szekvenciája nagyon magas konzerváltságú a homeodomain (98%-ban azonos aHsSix3-mal), a hatos domén (91%) és a groucho interakciós domén (71%) (lásd a kiegészítő anyag S1 ábráját). Megerősítettük korábbi vizsgálatainkat, amelyek szerint a Six3 dinamikusan fejeződik ki aParacentrotus lividus (Poustka etal., 2007), az ebben a vizsgálatban használt Strongylocentrotuspurpuratusszal közeli rokonságban álló faj fejlődése során (Poustka etal., 2007). A legfontosabb jellemzők, hogy aSix3 transzkriptumok a késői hasadás során az állati félgömbben (3A ábra), a kikelt blastula stádiumban az APD-ben (3B ábra), majd a mesenchyma blastula stádiumában két gyűrűben (3G,H ábra), az egyik az APD perifériája közelében (3C-F,H ábra), a másik az endomesodermában (3C-G ábra) expresszálódik. A gasztruláció során a Six3 expresszálódik néhány másodlagos mesenchimasejtben elszórtan a blastocoelben és az archenteron csúcsán (3I. ábra, nyíl), amint arról Howard-Ashby és munkatársai beszámoltak (Howard-Ashby etal., 2006b), az állati pólusban lévő sejtekben (3I. ábra, J) és az orális ektodermában (3J. ábra, K). A pluteus stádiumban a Six3 RNS a szájat flankáló két sejtcsoportban(3K ábra, nyilak) és a nyúlványos sávban (3K ábra) detektálható.

A Six mRNS összszintje a korai mesenchyma blastula stádiumban nem változik szignifikánsan Δcadherin mRNS beadásakor(1. táblázat). Az in situhybridizációk összhangban vannak ezzel az eredménnyel, és azt mutatják, hogy az eloszlás eltér a Δcadherin mRNS-injektált embriókban, hiányzik a vegetális sejtekből, és megtartja a széles állati féltekei expressziót, amelyet a korlátozás előtt a kánonikus Wnt-től függő folyamatok hoznak létre (lásd ábra. S2 a kiegészítő anyagban).

A Six3 funkciója szükséges az APD kialakulásához és a neuronok differenciálódásához

A Six3 funkciójának vizsgálatához két különböző Six3-transzlációt blokkoló morfolinót injektáltunk megtermékenyített petesejtekbe, amelyek mindegyike ugyanazokat a fejlődési hibákat idézte elő. A 3 napos embriók kerekded morfológiát öltöttek (4A,B ábra), és a tüskék vagy csökkentek, vagy hiányoztak. Az állati pólus ektoderma nem rendelkezett az állati lemezre jellemző megvastagodott hámmorfológiával (4. ábra, vö. A,B és C,zárójelben). Néhány embriótételben a gasztruláció normálisan zajlott, bár késve, és az archenteron helyzete azt mutatta, hogy az orális/aborális polaritás kialakult (4A. ábra). Más tételekben az embriók többsége exogasztrulált. A Six3-at nem tartalmazó embriókban a neurális differenciálódás erősen gátolt volt, amit a lategastrula és pluteus stádiumokban normálisan kifejeződő neurális markerek immunfestése mutatott ki (4. ábra, vö. A,B és C). Az embriók többsége (2/3-a) tartalmazott noserotonerg neuronokat, a többieknek pedig csökkent a száma (4D. ábra) az ebben a stádiumban normális számhoz képest (3-5). Ugyanez volt igaz az összes többi neuronra is, amelyeket a pán-neurális markerrel, a szinaptotagminnal (1e11) vizsgáltak (4A,B ábra), és amelyek a normális 3 napos embriók APD- és csillósávjában találhatók (4C ábra). Jelentős, hogy a hbn expressziója in situhibridizációval nem kimutatható szintre csökkent (4F. ábra versus 4E. ábra). A QPCR-mérések megerősítették ezt a megfigyelést, és azt mutatták, hogy mind a hbn, mind afoxq2 mRNS szintje, amelyek az APD külső határait, illetve belső részeit jelölik, 8-10-szeresére csökkent a Six3 morfantákban a témanchyme blastula stádiumban (5. ábra).

A Six3 szükséges az E-APDkészlet legtöbb génjének kifejeződéséhez

A Six3 elvesztése által létrehozott feltűnő fenotípus, valamint korai kifejeződése az embrióban azt sugallta, hogy a gén azAPD génszabályozó hálózat csúcsának közelében működhet. Ennek a lehetőségnek a további vizsgálatához mikroarray-elemzéssel Six3-függő géneket kerestünk 27 órakor, amikor az E-APD-készletben lévő gének megközelítik a maximális expressziós szintet. A Six3 endomezodermális funkcióinak kizárása érdekében ezt a szűréstΔkadherinnel injektált embriókban végeztük el. Amint az 5A. ábrán látható, a Six3 elvesztése ezekben az embriókban teljesen megszüntette a Δkadherin injektált embriókban talált összes felesleges neuron fejlődését, és nem alakult ki megvastagodott epithelium, ami szintén bizonyítja a Six3 fontos szerepét az APD fejlődésében. A microarraydata meglepően sok génelőrejelzést (682) azonosítottak, amelyek erősen downreguláltak (legalább 4-szeresen) aΔkadherin mRNS-t és Six3-MO-t kétszeresen injektált embriókban, összehasonlítva a csakΔkadherin mRNS-t injektált embriókkal. Továbbá, az összes gén több mint 60%-a az előző microarray screenben, amelyek legalább 3-szorosan felszabályozódtak aΔkadherin mRNS-sel injektált embriókban, és ezért valószínűleg az APD-ben fejeződtek ki, a Six3 elvesztésével jelentősen leszabályozódtak. Fontos, hogy a microarray adatok azt mutatták, hogy az E-APD gének többsége érzékeny a Six3-ra (5B ábra, sárga). Ezzel összhangban a QPCR-mérések két másik embriótételben azt mutatták, hogy csak 5 E-APD gén nem függött szignifikánsan a Six3-tól (5B. ábra, piros, kék).

A Six3 túlexpressziója elegendő az APD kiterjesztéséhez

Ezek az eredmények erőteljesen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a Six3 korán működik az APD génszabályozó hálózatokban, és felvetik annak lehetőségét, hogy elegendő lehet ahhoz, hogy az embrió más sejtjeit is APD-sorsra késztesse.A Six3 misexpressziója rendkívüli morfológiai változást mutató embriókat eredményezett. Sűrűn tömött sejtek patkó alakú sávja húzódott az állati pólustól vegetális irányban (6. ábra, vö. B,C és A).A szerotonerg neuronok, amelyek normális esetben az állati lemezre korlátozódnak (6D ábra), számuk 4-szeresére nőtt, és a sűrű sáv mentén oszlottak el (6G ábra). Továbbá, a szinaptotagmint tartalmazó sejtek (1e11) neurális nyúlványainak oszlopos alakja és elrendeződése hasonló a kontroll embriók állatlemezének alakjához (6E. ábra, fehér szaggatott doboz a 6H. ábrával szemben). E sejtek mindegyike tartalmazza a sejtmagjában az NK2.1-t (6J-M ábra, zöld), egy olyan transzkripciós faktort, amelyet általában az állati lemezben és a szomszédosupraorális ektoderma (6I. ábra, I′; zöld körök a 6U. ábrán), valamint néhány sejtet az előbélben fejeznek ki (Takacs és mtsai., 2004). Az 1e11-pozitív neurális sejtek lánca kettévágja a sávot (6K. ábra, piros), és az NK2.1-pozitív sáv belső oldalán lévő sejtek szintén Gsc-t expresszálnak (6L,N. ábra, piros). Az NK2.1 és a Gsc kombinációja egyedileg jelöli a szupraorális archámot az állatlemez orális szélén (6I. ábra, I′, sárga sejtek és 6U. ábra, sárga körök). A kiterjesztett sáv sűrűn tömörített oszlopos sejtjei laposabb epithelsejteket vesznek körül, amelyek NK2.1-et expresszálnak, de Gsc-t nem (6M,N ábra), akárcsak a normális embriók száj felső régióinak sejtjei (6I. ábra, száj, m). További bizonyíték arra, hogy ezek a sejtek hasonlóak a normális embriók szájához közeli sejtekhez, hogy hbn mRNS-t expresszálnak, amely a normális 3 napos embriókban az állati lemez pereme körül halmozódik fel, és a száj feletti ektoderma felé terjed (1. ábra, 6O. ábra). A Six3-misexpresszáló embriókban a hbn-pozitív sejtek a vékony hámban koncentrálódnak a vegetális póluson, és így a kiterjesztett állati lemezhez és a felső előbélben lévő Nk2.1-pozitív sejtekhez képest ugyanabban a helyzetben helyezkednek el, mint a normál embriókban (6P,Q ábra). Az orális régióval szemben lévő oldal vékonyhámos hámként differenciálódik, expresszálja az aborális ektoderma jelölőjét, a Spec1-et (6R-T. ábra), és megfelelhet az állatlemez melletti aborális ektoderma hbn-pozitív csíkjának. Ezek a génexpressziós mintázatok együttesen ahhoz a figyelemre méltó következtetéshez vezetnek, hogy a Six3 elegendő ahhoz, hogy újra specifikálja a sejtek sorsát az embrió többi részének nagy részében, létrehozva egy 3 napos embriót, amely egy jelentősen megnövekedett, de helyesen mintázott, orális/aborális polaritású állati pólus doménből áll. Az APD-t a normál és a Six3-misexpresszáló embriókban a 6U. ábrán kék körök jelölik.

A Six3 képes elnyomni a TGF-β jelátvitelt, de nem szünteti meg az orális/aborális polaritást

A Six3 misexpresszió nem szünteti meg az orális/aborális polaritást, mert az orális ésaborális ektoderma markerek az embrió ellentétes oldalain fejeződnek ki, és a normálisan az APD-ben található neuronok egy köztes sávra korlátozódnak.Azonban a misexpresszált Six3 csökkenti a nodális, valamint a lefty és a chordin expresszióját a mesenchyme blasztulákban (3. táblázat, balra), talán azért, mert a Six3 pozitív inputot ad a FoxQ2 expressziójához, amelyről kimutatták, hogy elnyomja a nodális expressziót (Yaguchi és mtsai.), Meglepő módon a Six3 nem nyomja el annyira a bmp2/4 mRNS felhalmozódását, mint amennyire csökkenti a nodálisat, noha a bmp2/4 kifejeződése normális embriókban megköveteli a nodális funkciót(Duboc és mtsai., 2004). Ez a látszólagos paradoxon a BMP2/4 jelátvitel csökkent Chordin által közvetített gátlásának kombinációjából eredhet, amely a BMP2/4 diffúziójával és az azt követő autoaktivációval párosul, amint azt más rendszerekben kimutatták (Biehs et al., 1996;Jones et al., 1992).

A kanonikus Wnt, nem pedig a TGF-β jelek megakadályozzák az APD terjeszkedését az oldalsó ektodermába

Az APD-t határoló jelek a kanonikus Wnt jelátviteltől függnek, mivel annak megszüntetése lehetővé teszi, hogy az APD szinte az egész embriót átfogja(Yaguchi et al., 2006)(1. ábra). Mivel a Nodal és a BMP a kanonikus Wnt jelektől függ, mindkét TGF-β ligandumot kiküszöböltük aNodal-MO-val (Yaguchi et al.,2008), hogy megvizsgáljuk, felelősek-e az APD Wnt-függő szűkítéséért. A 7B,F ábra azt mutatja, hogy ez nem így van, mivel a szerotonerg neuronok továbbra is az APD-re korlátozódnak ezekben az embriókban. Ha azonban a Nodal-morfánsokat exogén Six3-mal látják el, akkor a szerotonerg neuronok száma nagymértékben megnő, és az embrió egész állati felében megjelennek (7D. ábra), ahogyan azt aΔcadherin-misexpresszáló embriókban megfigyelték (Yaguchi és mtsai., 2006), amelyek a kanonikus Wnt-szignalizációt csökkentik. Ezért a Six3 ektopikus expressziója felülírhatja az egyéb jeleket, feltehetően a Wnt-t, amelyek ezeket az idegsejteket a normál embriókAPD-jére korlátozzák.

Noha a szerotonerg idegsejtek nem alakulnak ki a laterális ektodermában a nodalmorfantákban, néhány nem szerotonerg idegsejt igen(7B ábra). Ez elsősorban, ha nem is kizárólag a BMP2/4 jelátvitel elvesztéséből ered, mivel ugyanezt az eredményt kapjuk BMP2/4-MO injektált embriókban (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.A. és R. D. Burke, nem publikált). Mivel a normális embrióban minden neuron fejlődése aSix3-tól függ, megkérdeztük, hogy a Nodalmorfanták ektopikus neuronjai is függnek-e a Six3-tól, Nodal-MO és Six3-MO együttes injektálásával. Amint az várható volt, a Nodalmorfantokban az állati póluson jelenlévő szerotonerg neuronok a kettős morfantokban elvesztek (7G,H ábra). Ezek az embriók nem tartalmaznak differenciált, nem szerotonerg neuronokat axonális folyamatokkal,bár néhány 1e11-immunreaktív folt megfigyelhető. Ezek hiányosan differenciálódott neuronok jelenlétét jelezhetik, vagy az ektoderma sejtek kezdeti neurális torzítását tükrözhetik, amelyet a TGF-β jelátvitel normális esetben felülír.

A Six3 antagonizálhatja a Wnt jelátvitelt

A tény, hogy az APD nem bővül a Nodal morfánsokban, de aΔcadherin injektált embriókban igen, és hogy a Six3 le tudja küzdeni a kanonikusWnt-függő hatásokat a laterális ektodermában, felveti annak lehetőségét, hogy a Six3 elnyomja a Wnt jelátvitelt. E hipotézis alátámasztására azt találtuk, hogy a Six3misexpresszió a korai fejlődés során expresszálódó Wnt ligandumokat kódoló gének többségét downregulálja (3. táblázat, balra) (8. ábra).Ezek egyike a Wnt8, egy kulcsfontosságú vegetális jel, amely a normális endomesodermális fejlődéshez szükséges (Wikramanayake etal., 2004), ez az eredmény összhangban van a vegetális fejlődés hiányával a Six3-misexpresszáló embriókban. Ezek az eredmények együttesen arra utalnak,hogy az APD határait a Six3/Wnt antagonizmus határozza meg.

A Six3 nem elegendő a wnt és a nodal expressziójának elnyomására az APD-ben

A Six3 azon képessége, hogy (közvetlenül vagy közvetve) erősen lefelé szabályozza a Wnt ligandumokat, valamint a nodalt, a lefty-t és a chordin-t kódoló géneket,felveti annak lehetőségét, hogy normálisan megakadályozza ezen gének expresszióját az APD-ben. Ennek értékeléséhez először megvizsgáltuk a Six3 hatását a Δkadherinnel injektált embriók génexpressziójára, hogy kizárjuk a Six3 endomezodermában való működésének esetleges ellentétes hatásait. Mind a microarray-, mind a QPCR-adatok azt mutatják, hogy a főként APD-ből álló embriókban a Six3elnyomja a Wnt-gének, valamint a nodális, a lefty és achordin gének expresszióját (3. táblázat;8. ábra). Normál embriókban (glicerininjekcióban) azonban ezeknek a géneknek a Six3 repressziója nem mutatható ki(3. táblázat;8. ábra), ami arra utal, hogy további mechanizmusok védik az APD-t a Wnt és a TGF-β expressziójától a normális embrióban.

Six3 szabályozása más jelátviteli utakon

A Six3 pozitívan szabályozza (közvetlenül vagy közvetve) a más jelátviteli utakban működő fehérjéket kódoló géneket is(3. táblázat). Ezek közé tartozik a Delta, a Notch ligand, amely közvetíti a laterális gátlást, az idegrendszer fejlődésének egyik kulcsfontosságú folyamatát, valamint az idegfejlődés más potenciális szabályozóit. Ez utóbbiak közé tartozik az fgf9/16/20, az fgfr-szerű, membránhoz kötött receptor, amelyből hiányzik a tirozinkináz domén, és a frizzled5/8, egy Wnt-receptor, amely nem kanonikus jeleket közvetíthet, de amelynek funkciója az APD-ben ismeretlen (Croce etal., 2006). A jövőbeni vizsgálatok azt fogják vizsgálni, hogy e jelátviteli útvonalak és a korai Six3-függő transzkripciós faktorok tevékenysége hogyan hat egymásra az APD génszabályozó hálózatában.