Az állatok
S. purpuratus-t mesterséges tengervízben tartották 14 °C-on. A L. anatinákat 2016 júniusában gyűjtötték be a Xiangshan vizes élőhelyen, Xiangshan kerület, Hsinchu város, Tajvan (GPS-koordináták 24.770779, 120.910742 E), jégen szállították a laboratóriumba, majd azonnal felboncolták őket.
Konstrukciók és plazmidok
A SpAIDL-ek és LaAIDL-ek enzimaktivitásának meghatározásához a SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 és HsAID számára pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID megfelelő bakteriális expressziós vektorokat készítettünk. Az egyes SpAIDL-ek nyitott leolvasási kereteit genomi DNS-ből PCR-rel, Phusion polimeráz és SpeI és XhoI restrikciós helyeket tartalmazó primerek segítségével amplifikáltuk (1. kiegészítő táblázat). A PCR-termékeket SpeI-vel és XhoI-val (New England Biolabs) emésztettük, és a TadA nyílt olvasókeretet helyettesítő pASK-TadA (Dr. Nina Papavasiliou (Rockefeller Egyetem, New York) ajándéka) NheI/XhoI-helyeire illesztettük be. Az SpAIDL9 esetében ez a klónozási stratégia a harmadik aminosavat fenilalaninról szerinre változtatta, és ezt az F3S mutációt a Quikchange mutagenezis kit (Stratagene) és a SPA9S3FT/SPA9S3FB primerek segítségével visszaállítottuk F3-ra (1. kiegészítő táblázat). A HsAID-t a humán teljes hosszúságú AID-t tartalmazó plazmidból (pCDF-AID, Dr. Nina Papavasiliou (Rockefeller Egyetem, New York) ajándéka) amplifikáltuk. A klónozási stratégia a második aminosavat aszpartátról alaninra változtatta, és a D2A-t a Quikchange mutagenezis kit (Stratagene) és a hAIDA2DT/hAIDA2DB primerek segítségével D2-re állítottuk vissza (1. kiegészítő táblázat). Az üres pASK-t a pASK-TadA NheI/XhoI emésztésével, a túlnyúlások Klenow-polimerázzal történő kitöltésével és T4 DNS-ligázzal (Thermo Scientific) történő ligálásával hoztuk létre. Az egyes LaAIDL-ek nyitott leolvasási kereteit L. anatina cDNS-ből amplifikáltuk és klónoztuk a pJET1.2/blunt klónozó vektorba (Thermo Scientific). A LaAIDLX nyílt leolvasási kereteket SpeI és XhoI (New England Biolabs) segítségével kivágtuk, és a pASK_V5-SpAID4a XbaI/XhoI-helyeire klónoztuk (lásd alább), a SpAID4a inszert helyettesítve. Meg kell jegyezni, hogy a klónozott fragmentumok 3′ végükön az eredeti stopkódonokat tartalmazzák, így az expresszált fehérje nem tartalmaz V5 taget.
A SpAIDL1 és a LaAIDL1 aktív centrummutánsainak (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, és LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) a megfelelő vad típusú (vagy egyetlen mutáns) plazmidokból a Quikchange mutagenezis kit (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB a SpAIDL1 RQ esetében) segítségével, hely-irányított mutagenezissel hoztuk létre, vagy hagyományos PCR-rel, 5′-foszforilált primerek használatával (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB a SpAIDL1 RQAA második módosítási sorozatához, valamint LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P és LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P a SpLaAIDL1 RQRQ-hoz), majd DpnI emésztés, ligálás a termékek cirkularizálása érdekében, és transzformáció kompetens E. coli.
A rekombináns fehérje E. coliban történő expressziójának nyomon követése érdekében létrehoztuk a pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAIDLX/HsAID bakteriális expressziós konstrukciókat. A pASK_V5 a V5 tag szekvenciát tartalmazó pASK_V5F/pASK_V5R oligonukleotidok (Kiegészítő táblázat 1) lágyításával és a pASK-TadA NheI/SalI helyére történő ligálásával jött létre. A pASK-SpAIDLX/LaAIDLX plazmidokat sablonként használtuk a megfelelő cDNS-ek stop kodon nélküli felerősítéséhez Phusion polimeráz és az 1. kiegészítő táblázatban felsorolt primerek segítségével, és klónoztuk a pASK_V5 NheI/XhoI helyeire (a SpAIDLX és HsAID fragmensek esetében) vagy XbaI/XhoI helyeire (a LaAIDLX fragmensek esetében). A HsAID-et a pASK-hAID-ból amplifikáltuk. Mind az SpAIDL9, mind a HsAID szekvenciáját ez a klónozási stratégia ismét megváltoztatta, és a fent leírtak szerint visszaállítottuk a helyes szekvenciákra.
Genomi DNS előkészítés
A S. purpuratus és a L. anatina genomi DNS-eit a gDNS Spin Kit Tissue (Bioman) segítségével tisztítottuk a gyártó utasításait követve. Röviden, körülbelül 1 × 106 S. purpuratus coelomocitát és 100 mg L. anatina szövetet adtunk külön mikrocentrifugacsövekbe, 200 µl 200 mg proteináz K-t tartalmazó GT pufferben (Bioman) homogenizáltuk, és 30 percig inkubáltuk 60 °C-on a sejtek teljes líziséhez. 200 µl BG puffer (Bioman) hozzáadása után a mintákat vortexeltük és 20 percig inkubáltuk 70 °C-on. Ezt követően 200 µl etanolt adtunk hozzá, és a teljes mintát egy GD spin oszlopra (Bioman) töltöttük. A 400 µl WI pufferrel (Bioman) és 600 µl mosópufferrel történő mosást 10 000×g-nél 30 másodpercig tartó centrifugálással végeztük. Ezt követte a genomi DNS-ek elúciója 100 µl elúciós pufferrel (10 mM Tris pH = 8,0), amelyet 60 °C-ra előmelegítettünk.
RNS-előkészítés és cDNS-szintézis
A S. purpuratus coelomikus folyadékát fecskendővel szívtuk át a periostomális membránon, és azonnal összekevertük azonos mennyiségű CMSFW-EI-vel (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazol). A coelomocitákat összeforgattuk és 800 μl EasyPure Total RNA Reagensben (Bioman) reszuszpendáltuk. A S. purpuratusból a nyelőcsövet, a vékonybelet, a vastagbelet és a gonádokat, a L. anatinából pedig a pedikulát, az emésztőcsatornát, a gonádokat és a beleket boncoltuk ki az egyes állatokból. A S. purpuratus és a L. anatina szilárd szöveteinek kis darabjait 200 μl EasyPure Total RNA Reagenshez (Bioman) adtuk, majd a mintákat 0,5 mm-es ZrO gyöngyökkel Bullet Blenderben (Next Advance) homogenizáltuk. Az oldhatatlan törmeléket lepergettük, és a felülúszókat 600 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) és 200 μg glikogént hordozóként 200 μg glikogént tartalmazó friss csövekbe töltöttük. A teljes RNS-t ezután a gyártó protokollja szerint tisztítottuk. A maradék gDNS és egyéb szennyeződések eltávolítása érdekében a S. purpuratus RNS-t ezután a Turbo DNA-free kit (Ambion) vagy az RNeasy mini kit (Qiagen) segítségével dolgoztuk tovább. A Turbo DNA-free kitet (Ambion) a gyártó protokollja szerint használtuk, kivéve, hogy a DNáz emésztéshez extra MgCl2-t (2,5 mM) és CaCl2-t (1 mM) adtunk. Az RNeasy mini kitet (Qiagen) a gyártó protokollja szerint használtuk.
Az egyes szövetekből származó kb. 250-500 ng S. purpuratus és L. anatina RNS-t a ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen), illetve a ToolsQuant II Fast RT Kit (Biotools) segítségével alakítottuk cDNS-vé. Mindkét esetben random hexamereket használtunk, és követtük a gyártó utasításait.
A cDNS-végek gyors amplifikációja
A SpAIDL9 transzkriptek 5′ és 3′ végét a SMARTer RACE kit (Clontech) és a génspecifikus SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 primerek (lásd a 2. kiegészítő táblázatot) segítségével amplifikáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az átiratok 5′ és 3′ végét tartalmazó PCR-termékeket a pJET1.2/blunt klónozó vektorba (Thermo Scientific) klónoztuk, és az egyes klónokat teljes egészében szekvenáltuk.
A SpAIDL gének szekvenciaelemzése
A három S. purpuratus egyedekből (Sp105, Sp111, Sp112) vettünk mintát a SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 nyitott leolvasási kereteinek felerősítéséhez Phusion polimeráz és a 2. kiegészítő táblázatban felsorolt primerek segítségével. A PCR-termékeket a pJET1.2/blunt klónozó vektorba (Thermo Scientific) klónoztuk. A plazmidokat a Tools mini plazmid kit (Biotools) segítségével tisztítottuk meg, és egy kereskedelmi szolgáltatásnak (Genomics Taiwan) küldtük be szekvenálásra a pJET1.2 forward vagy a pJET1.2 reverse primerek használatával.
Minden génhez legalább nyolc szekvenciát gyűjtöttünk minden egyes tengeri sünből, és a primer szekvenciákat a szekvenciaillesztések előtt kizártuk. Az egyes gének nukleotidszekvenciáit először minden egyes S. purpuratuson belül a CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw) segítségével igazítottuk egymáshoz, majd a két allélnak megfelelő domináns szekvenciákat választottuk ki az egyes tengeri sünök közötti későbbi összehasonlításhoz.
Gén-expressziós elemzés
Három egyed S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) és két egyed L. anatina (La1 és La3) komplementer DNS-ét használtuk sablonként az SpAIDL1, 2, 3, 4a és 9, illetve a LaAIDL1 és 2 expressziójának kvantitatív PCR segítségével történő vizsgálatához. Minden qPCR-reakció (10 μl) 5 μl Fast SYBR Green Master Mixet (Applied Biosystems), primereket (0,1 μM) (lásd a 3. kiegészítő táblázatot) és 1 μl templátot tartalmazott, és minden minta esetében két technikai ismétlést állítottunk be. A qPCR-reakciókat egy 7500 Fast Real-Time PCR rendszerben (Applied Biosystems) végeztük, egy kezdeti denaturációs lépést alkalmazva 95 °C-on 20 másodpercig, majd 40 ciklust, 3 másodpercet 95 °C-on és 30 másodpercet 60 °C-on. A génexpressziós szintek meghatározásához standard görbéket használtunk, a normalizáláshoz pedig házőrző géneket (Sp18S a S. purpuratus esetében és LaRPL39 a L. anatina esetében) használtunk.
Bakteriális fertőzési modell
A Vibrio diazotrophicusokat Difco marine broth (Becton Dickinson) folyadékkultúrákban 30 °C-on és 250 rpm-en növesztettük egy éjszakán át. Hat egészséges tengeri sünt véletlenszerűen kiválasztottunk és két csoportra osztottunk, egy kísérleti és egy kontrollcsoportra. A kísérleti csoportba tartozó tengeri sünökbe 200 µl steril mesterséges tengervízben lévő élő Vibrio diazotrophicus szuszpenziót fecskendeztünk, a baktériumok mennyiségét minden egyes tengeri sün esetében úgy állítottuk be, hogy az megfeleljen 106 sejt/ml teljes coelomikus folyadékmennyiségnek. A kontrollcsoportba 200 µl steril tengervizet fecskendeztek. A t = 6, 24 és 48 órakor minden egyes csoport minden egyes állatából 200 µl coelomikus folyadékot vettek. Az egyes időpontokban nyert coelomocitákból RNS-t vontunk ki, és a t = 0 mintákból genomi DNS-t is készítettünk. A génexpressziós elemzéshez használt primerpárokat (3. kiegészítő táblázat) először a genomi DNS-mintákon teszteltük, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a S. purpuratus-populáción belül a szekvenciájukban megfigyelhető jelentős mértékű polimorfizmus ellenére minden egyedből képesek felerősíteni a megfelelő gént (lásd az 1b. ábrát). A génexpressziós szintek mérésére kvantitatív RT-PCR-t alkalmaztunk (a fent leírtak szerint), mintánként legalább két technikai ismétléssel. Az expressziós értékeket először minden egyes mintában a 18S szintjére, majd az egyes állatok t = 0 értékére normalizáltuk. A kísérleti és a kontrollcsoporthoz három biológiai ismétlést használtunk, és minden adatpontot feltüntetünk.
CDA-mérések kanamicin-rezisztencia riporterrel
A polinukleotid CDA aktivitás mérésére egy széles körben használt vizsgálat26 optimalizált protokollját használtuk. A KanR génben L94P pontmutációt tartalmazó pTAC-Kan deamináz riporter plazmidot és az egyes pASK-SpAIDLX/LaAIDLX expressziós vektorokat egymás után transzformáltuk az UNG-hiányos BH156 E. coli törzsbe. A pASK-HsAID humán AID expressziós vektor és az üres pASK vektor szolgált pozitív, illetve negatív kontrollként. A deamináz-teszthez minden egyes feltételezett deamináz esetében legalább nyolc egyedi kolóniát növesztettünk LB-lében (amely 50 μg/ml ampicillint (Amp), 50 μg/ml spektinomicint (Spc) és 17 μg/ml klóramfenikolt (Cam) tartalmazott), amíg a 600 nm-en mért optikai sűrűség el nem érte a 0,3 értéket. Ezután minden tenyészetet kettéválasztottunk. Míg IPTG-t (1 mM) mindkettőhöz adtunk, anhidrotetraciklin (AHT) (0,2 μg/ml) csak az egyikhez adtunk a SpAIDLX/LaAIDLX expressziójának indukálása érdekében. A 37 °C-on és 200 rpm-en végzett 3 órás inkubáció után a tenyészeteket lecsavaroztuk, PBS-szel mostuk, majd LB lemezekre terítettük, amelyek vagy 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc és 17 μg/ml Cam, vagy 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc, 17 μg/ml Cam és 30 μg/ml kanamicint (Kan) tartalmaztak. A reverziós gyakoriságokat a KanR telepek számának és az Amp+Spc+Cam lemezen lévő telepek teljes számának hányadosaként számoltuk ki. A relatív reverziós gyakoriságot ezután egy pár azonos baktériumtenyészetből származó reverziós gyakoriságok arányaként határoztuk meg, amelyekben a KanR transzkripciót IPTG-vel indukáltuk a deamináz expresszió jelenlétében vagy hiányában. Annak megerősítésére, hogy a KanR-kolóniák valóban DNS-deamináció eredménye, a több kolóniából származó pTAC-Kan plazmidokat megtisztítottuk, és a stop-kodon reverzióját DNS-szekvenálással igazoltuk.
CDA-kísérletek rpoB-t riporterként használva
A polinukleotid CDA aktivitás mérésére széles körben használt teszt optimalizált protokollját35 használtuk. A gerinctelen deaminázok egyes pASK-expressziós vektorait külön-külön transzformáltuk UDG-hiányos BH156 E. coliba. Négy ml LB táptalajt tartalmazó, 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam és 0,3 µg/ml AHT-t tartalmazó kultúrákat oltottunk be egyes baktériumtelepekkel. A tenyészeteket 24 órán keresztül 37 °C-on 230 rpm-en növesztettük, aliquotokat 100 µg/ml Ampot vagy 100 µg/ml rifampicint tartalmazó LB agar lemezekre ültettünk, és 37 °C-on növesztettük egy éjszakán át. A kolóniákat megszámoltuk, és a reverziós gyakoriságot a RifR-kolóniák számának és az ugyanabból a kultúrából származó AmpR-kolóniák számának arányaként számoltuk ki. A HsAID-ot expresszáló, illetve az üres pASK expressziós vektort tartalmazó kultúrák szolgáltak pozitív, illetve negatív kontrollként. Expressziós konstrukciónként legalább nyolc kultúrát vizsgáltunk. A rpoB gén rifampicin-rezisztens kolóniákból származó mutációk azonosságának meghatározásához 24 egyedi kolóniából kolónia PCR-t végeztünk Phusion polimeráz és az rpoBF/rpoBR primerpár segítségével. A PCR-termékeket géltisztítottuk és szekvenálásnak vetettük alá az rpoBF primer használatával. A mutációkat a WT szekvenciával (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797) való összehasonlítással azonosítottuk.
Szervezetlen deaminázok fehérjeexpressziója E. coli-ban
A SpAIDLX/LaAIDLX expressziós szintjének a deamináz-kísérletekben történő monitorozásához a pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX-et UNG-deficiens BH156-ba transzformáltuk. Az egyes kolóniákat LB-lében (amely 50 μg/ml Ampot, 50 μg/ml Spc-t és 17 μg/ml Camot tartalmazott) addig növesztettük, amíg a 600 nm-en mért optikai sűrűség 0,3 nem lett. IPTG-t (1 mM) és AHT 0,2 (μg/ml) adtunk a tenyészethez a fehérjeexpresszió indukálása érdekében. A 3 órás inkubációt követően (37 °C, 200 rpm) a kultúrákat pelletáltuk és PBS-szel mostuk. A pelleteket 2x SDS mintapufferben lizáltuk, tízszeresére hígítottuk és 10%-os SDS-PAGE gélpáron elválasztottuk. Míg az egyik gélt Coomassie-kékkel festettük annak megállapítására, hogy egyenlő mennyiségű fehérjék töltődtek-e be, a másik gélt félszáraz transzferrel PVDF-membránra vittük át, és a V5-jelölésű deaminázokat egér anti-V5 primer antitest (Abcam, ab27671) és torma-peroxidázzal kapcsolt nyúl-anti-egér másodlagos antiszérum (Jackson ImmunoReasearch) segítségével detektáltuk. A kemilumineszcens jeleket az Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) és röntgenfilm vagy ChemiDoc Touch (BioRad) képalkotó rendszer segítségével vizualizáltuk. Az összes festett fehérje gélről és western blotról készült vágás nélküli képeket az 5. kiegészítő ábra mutatja. Minden bakteriális expressziós kísérletet két példányban végeztünk.
Bioinformatika
A tengeri sün genommal való szekvencia-összehasonlításokat BLAST, BLASTP vagy BLASTN segítségével végeztük a https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi vagy a www.echinobase.org címen, standard paraméterekkel vagy kikapcsolt alacsony komplexitású szűrővel. A többszörös szekvencia-illesztéseket a CLUSTALW segítségével végeztük el, és manuálisan optimalizáltuk a megjósolt másodlagos szerkezeti jellemzők alapján. A filogenetikai és molekuláris evolúciós elemzéseket a MEGA (7. verzió)36 segítségével végeztük.
Adatok elérhetősége
Az e tanulmány eredményeit alátámasztó szekvenciaadatokat a Genbankban a következő hozzáférési kódokkal helyeztük el: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).