Antioxidáns enzimek, gyulladásos indexek és életmódbeli tényezők idősebb férfiaknál: kohorszelemzés

Abstract

A Caerphilly prospektív, ischaemiás szívbetegséggel kapcsolatos kohorszvizsgálatban vizsgáltuk a vér antioxidáns enzimaktivitása, a gyulladásos állapot indexei és számos életmódbeli tényező közötti kapcsolatot. A vizsgálat 1979-ben kezdődött, és reprezentatív férfi lakossági mintán alapul. Kezdetben 2512 férfit vizsgáltak az I. fázisban, majd 5 évenként követték őket a II. és III. fázisban; nemrégiben a IV. fázisban vizsgálták őket. A társadalmi osztályra, a dohányzási szokásokra, az alkoholfogyasztásra vonatkozó adatokat kérdőívvel gyűjtötték be, és megmérték a testtömegindexet. Az antioxidáns enzimaktivitást és a gyulladásos állapot indexeit standard technikákkal becsülték. Szignifikáns összefüggést figyeltek meg: az életkor az α-1-antichymotrypsin (p<0,0001) és a caeruloplasmin, mind a fehérje, mind az oxidáz (p<0,0001); a dohányzási szokás az α-1-antichymotrypsin (p<0,0001), a caeruloplasmin, mind a fehérje, mind az oxidáz (p<0,0001) és a glutation-peroxidáz (GPX) (p<0,0001.0001); társadalmi osztály az α-1-antichymotrypsinnel (p<0,0001), a caeruloplasmin fehérjével (p<0,001) és oxidázzal (p<0,01) és a GPX-szel (p<0,0001); testtömegindex az α-1-antichymotrypsinnel (p<0,0001) és a caeruloplasmin fehérjével (p<0,001). Az alkoholfogyasztás és a mért vérképző enzimek egyike között sem volt szignifikáns összefüggés. A faktorelemzés egy háromfaktoros modellt eredményezett (amely az adatsor variációjának 65,9%-át magyarázta), ami az antioxidánsok közötti szoros összefüggésekre utalt.

Bevezetés

Az iszkémiás szívbetegség továbbra is a halálozás egyik fő oka Európában és az USA-ban.1 Az utóbbi években nagy érdeklődés övezi a szabad gyökök kóros szerepét az ateroszklerózis kialakulásában.2-5 A szervezet komplex védekezési stratégiát fejlesztett ki a különböző oxidánsok károsító hatásainak minimalizálására. Ennek a védelemnek a középpontjában a vér antioxidáns enzimjei állnak. Ezek közé tartozik a szuperoxid-dizmutáz (SOD, EC 1.15.1.1.1), a glutation-peroxidáz (GPX, EC 1.11.1.9), a kataláz (EC 1.11.1.6) és a caeruloplasmin, amelyek összehangoltan védik a szervezetet az oxidatív károsodástól6. Az eritrocita szuperoxid-dizmutáz rézfüggő (bár a cinknek szerkezeti szerepe van), és felgyorsítja a szuperoxid O2-nek H2O2-re és O2-re történő dismutációját.7 A szeléntartalmú glutation-peroxidáz enzim úgy méregteleníti a H2O2-t, hogy szubsztrátként redukált glutationt (GSH) és H2O2-t használ fel H2O és oxidált glutation (GSSG) előállításához;8 a GSSG-t pedig a glutation-reduktáz enzim redukálja GSH-vá, amihez redukálószerként NADPH-ra van szükség; ez utóbbit a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzim (G-6-PDH, EC 1.1.1.49). A kataláz egy nagyméretű enzim, amely aktív helyein hemhez kötött vasat tartalmaz. A H2O2-t közvetlenül O2-re bontva távolítja el.9 A plazmában a kaeruloplazmin (oxidáz) fontos antioxidánsként működik a szervezet oxidatív stresszel szembeni védelmében. Ez utóbbi enzim az alfa-1-antichymotripszinnel együtt akut fázisú reaktáns is, és a gyulladásos állapot jelzésére használható.

A halmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy e védekező enzimrendszerek változásai vagy zavarai hozzájárulhatnak az ateroszklerózis kialakulásához vagy súlyosbíthatják azt.10-12 Más tanulmányok, amelyek az öregedés hatását vizsgálták a szívizom antioxidáns enzimaktivitására és a lipidperoxidációra patkányokon, kimutatták, hogy az öregedés során a szívizom antioxidáns kapacitása gyengül, ami növeli az oxidatív károsodás lehetőségét.13 Embereknél kimutatták, hogy a dohányzás, az ateroszklerózis egyik fő kockázati tényezője csökkenti a plazma glutation-peroxidáz aktivitását.14 A tanulmány szerzői szerint ez az eredmény összhangban van azzal a nézettel, hogy a dohányosok tartós oxidatív terhelésnek vannak kitéve, és hogy a nem megfelelő antioxidáns-státusz a dohányzás okozta fokozott szabadgyök-terheléssel együtt súlyosbíthatja az LDL oxidációját és növelheti aterogén tulajdonságait. Ez különösen igaz lehet a koszorúér-betegség magas kockázatának kitett populációban. Csökkent glutation-peroxidáz, szuperoxid-dizmutáz és kataláz aktivitást figyeltek meg koszorúér-betegségben szenvedő egyének vérlemezkéiben15 és akut szívinfarktusban szenvedő egyénekben is.16-17

Az antioxidáns enzimaktivitást és a szívbetegséget vizsgáló vizsgálatok többsége erősen szelektált alanyokon, viszonylag kis minták felhasználásával készült. Az ischaemiás szívbetegség, a stroke és a kognitív hanyatlás Caerphilly prospektív kohorszvizsgálata lehetőséget adott a vér antioxidáns enzimaktivitásának vizsgálatára egy reprezentatív férfi lakossági mintán, valamint az antioxidáns enzimaktivitás, az életkor, a társadalmi osztály, a dohányzási szokások és az alkoholfogyasztás közötti lehetséges összefüggések feltárására.

Módszerek

A Caerphilly kohorsz és a szívbetegség, a stroke és más betegségek szempontjából lényeges adatok gyűjtésének teljes leírását máshol már közölték;18-21 itt csak egy rövid leírást adunk. Kezdetben 2512 férfit vizsgáltak az I. fázisban (1979-1983), amikor 45-59 évesek voltak. A férfiakat ezt követően minden 5 éves időszak után nyomon követték (a II. és III. fázisban), és nemrégiben a IV. fázisban is megnézték őket. Amikor a férfiak 55-69 évesek voltak (III. fázis), éhgyomri vérmintát vettek a vér antioxidáns vitaminjainak és enzimjeinek becsléséhez. Sajnos a férfiak vizsgálatai néhány hónappal azelőtt kezdődtek, hogy lehetőség nyílt volna ezekre a becslésekre, és néhány száz férfitól nem tudtak vért venni az antioxidánsok becsléséhez. A vérplazmát kis sebességű centrifugálással választották el az eritrocitáktól, és az eritrocitákat fiziológiás sóoldattal mosták. Mind a plazmát, mind a mosott eritrocitákat -70 °C-on tároltuk az elemzés előtt.

Az antioxidáns enzimeket standard módszerekkel becsültük az alábbiak szerint. A szuperoxid-dizmutáz, a glutation-peroxidáz és a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz aktivitását Cobas Fara automatikus analizátorral becsültük a Randox Laboratories által forgalmazott, kereskedelmi forgalomban kapható készletekkel. Az eritrocita kataláz aktivitást Aebi22 módszerével becsültük Varian Cary 1 spektrométerrel. Az eritrocita hemoglobint (Hb) a Dacie és Lewis23 által leírt módszer módosításával mértük egy erre a célra kifejlesztett hemoglobinométer (Coulter Electronics) segítségével. A vizsgálatot a gyártó által ajánlott B.S. 3985 (BDH) szabványnak megfelelő ciánmetaemoglobin (HiCN) standarddal kalibrálták. Az alfa-1-antichymotripszin és a caeruloplasmin akut fázisú fehérjéket immunoturbidometriás módszerekkel és a Dako által szállított kereskedelmi készletekkel becsültük, azzal a különbséggel, hogy az ezen elemzésekhez használt aliquotokat a Cobas Fara automatikus analizátorral történő vizsgálat előtt nem automatikusan, hanem kézzel hígítottuk. A kaeruloplazmin-oxidáz (CpO) aktivitását a Cobas Fara készülékkel becsültük meg, p-feniléndiamin-dihidrokloridot használva szubsztrátként.24 A tételen belüli és a tételek közötti eltérés <6,5% volt az összes mért analit esetében.

A további adatokat, beleértve a dohányzási szokásokat, a társadalmi osztályt, az alkoholfogyasztást és a testtömegindexet kérdőívvel, illetve fizikai méréssel gyűjtöttük; a teljes részleteket korábban leírtuk.19

Statisztikai elemzés

A különböző mért paraméterek eloszlásait a Kolmogorov Smirnov-teszt segítségével vizsgáltuk a normalitás szempontjából. Az eredményeket átlagok, mediánok és standard eltérések (SD-k), valamint adott esetben az adatok transzformációja után kapott átlagok és 95%-os tartományok formájában mutatjuk be. A különböző adatsorok közötti összefüggéseket korrelációval, korrelációs mátrixban történő regresszióval és faktorelemzéssel vizsgálták, és ezek esetében a változókat – általában logaritmusra – transzformálták, hogy adott esetben normális vagy közel normális értékeket kapjanak. A faktorelemzéseket azért végezték, hogy viszonylag kis számú faktort vagy mögöttes konstrukciót vonjanak ki, amelyek leegyszerűsítik a változók összefüggéseit, és így megkönnyítik az összetett folyamatok megértését.

Eredmények

A kohorszban a III. fázisú vizsgálatok idején (1989-1993) 2154 férfi volt. Közülük 1800-tól vettek éhgyomri vérmintát, ami a teljes kohorsz 84%-át jelenti.

A Caerphillyi férfi kohorszban vizsgált antioxidáns enzimek átlagai, mediánjai és SD-értékei az 1. táblázatban láthatók. Csak a SOD és a GPX normális eloszlásúnak bizonyult. Az eredményeket valamennyi enzim esetében nyers adatokként és log-transzformációt követően is bemutatjuk. A kohorsz különböző antioxidáns enzimjei közötti összefüggéseket (korrelációs együtthatók formájában) a 2. táblázat mutatja be. Szignifikáns korrelációkat figyeltek meg számos mérőszám között, különösen azok között, amelyek a gyulladásos státuszon keresztül kapcsolódnak, azaz az alfa-1-antichymotripszin és a caeruloplasmin (fehérje és oxidáz) között. A vér enzimszintek összefüggéseit számos változóval is összehasonlították, különösen: életkor, dohányzási szokások, társadalmi osztály, testtömegindex és alkoholfogyasztás. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja be. Az adatokat nyers adatokként és standardizálva is vizsgálták, hogy figyelembe vegyék a zavaró tényezők lehetséges hatásait. A kettő között nem volt jelentős különbség. Ezért csak a standardizált adatokat mutatjuk be. Szignifikáns összefüggéseket figyeltek meg a következők esetében: életkor az alfa-1-antichymotripszinnel és a caeruloplasmin fehérjével és oxidázzal; dohányzási szokás az alfa-1-antichymotripszinnel, a caeruloplasmin (fehérje és oxidáz) és a GPX-szel; társadalmi osztály az alfa-1-antichymotripszinnel, a caeruloplasmin (fehérje és oxidáz) és a GPX-szel; testtömegindex az alfa-1-antichymotripszinnel és a caeruloplasmin fehérjével. Az alkoholfogyasztás és a mért vérképző enzimek egyike között sem volt szignifikáns összefüggés.

Amikor a hét plazmaváltozóra (n=1689) faktoranalízist alkalmaztunk, két közös faktort kaptunk 2,24 és 1,40 sajátértékkel, amelyek együttesen az adathalmaz teljes variációjának 52,1%-át magyarázták. Az 1. faktor az adathalmaz teljes variációjának 32,0%-át magyarázta. Leginkább az alfa-1-antichimotripszinnel, a caeruloplazmin fehérjével és az oxidázzal (és kevésbé jelentős mértékben a SOD-dal és a katalázzal) állt kapcsolatban. A 2. tényező a teljes variáció további 20,1%-át magyarázta. Leginkább a SOD-dal, a katalázzal, a G-6-PDH-val és a GPX-szel állt kapcsolatban.

A modell megfelelőségének mérései megfelelőek voltak, azzal a figyelemre méltó kivétellel, hogy három változó alacsony kommunalitása (0,42 a SOD, 0,34 a G-6-PDH, 0,18 a GPX esetében) nem tette elfogadhatóvá a modellt.

Egy háromtényezős modellt is konstruáltunk. Bár a harmadik faktor az adathalmaz teljes variációjának kismértékben kisebb részét magyarázza, mint egy egyedi változó, a változók kommunalitása (és a modell megfelelőségének egyéb mérőszámai) javulnak, ami azt jelzi, hogy ez a modell jobban leírja a megfigyelt változók közötti összefüggéseket. A 3. tényező az adathalmaz teljes variációjának további 13,8%-át magyarázza, így a háromtényezős modell összességében 65,9%-os. Az 1. faktor továbbra is az alfa-1-antichymotripszinnel, a caeruloplasmin fehérjével és az oxidázzal áll a legszorosabb kapcsolatban. A 2. faktor a SOD-hoz és a katalázhoz (és sokkal kisebb mértékben a G-6-PDH-hoz) kapcsolódik a legszorosabban. A 3. faktor a GPX-hez és a G-6-PDH-hoz kapcsolódik a legszorosabban.

A háromfaktoros modell megfelelőségének legszembetűnőbb javulása a kétfaktoros modellhez képest a GPX kommunalitásának javulása (0,18-ról 0,78-ra). A SOD és a G-6-PDH kommunalitása is javult (0,63-ra és 0,42-re). Úgy tűnik, hogy a GPX-nek olyan különleges szerepe van, amelyet a háromtényezős modell nem tartalmaz.

Diszkusszió

A Caerphillyi férfi kohorszot a projekt 1979-es indulása óta kiterjedten tanulmányozták.25-29 A jelenlegi adatok egyik erőssége, hogy reprezentatív lakossági mintából származnak. A dél-walesi Caerphilly egy tipikus ipari/lakótelepi terület, bár a társadalmi osztályok szerinti megoszlás azt sugallja, hogy a manuális foglalkozások felé lehet némi torzulás. A jelen tanulmány célja leíró statisztikák készítése és a vér antioxidáns enzimaktivitások közötti lehetséges összefüggések vizsgálata volt, adatcsökkentő és hipotézisalkotó technikaként faktorelemzést alkalmazva. Ezenkívül megvizsgáltuk az antioxidáns enzimek és számos életmódváltozó közötti lehetséges összefüggéseket. Bár jelenleg nincsenek végleges referenciatartományok a SOD, GPX és kataláz antioxidáns enzimekre, az eredményeket először a korábban publikált adatokkal hasonlítottuk össze, mielőtt az antioxidáns enzimek és az életmódbeli tényezők közötti lehetséges kapcsolatokat vizsgáltuk.

A SOD-aktivitást egy mintában közvetve számszerűsítjük azáltal, hogy a minta képes csökkenteni a kimutatott szabadgyök-áramot. A SOD-aktivitás a különböző vizsgálati rendszerek között változik, ezért a kitek gyártói nem ajánlanak referencia-tartományokat. A Caerphilly-mintán kapott adatok azonban összehasonlíthatók az ugyanazon analitikai kit használatával korábban közzétett eredményekkel.30 A GPX aktivitása szintén változhat a vizsgálati rendszereken belül és azok között. Úgy gondolják, hogy az oxidált GPX érzékeny a cianid általi inaktiválásra, amelyet a mintákban lévő hemoglobin stabilizálására és más enzimreakciók megakadályozására használt Drabkins-reagens tartalmaz.31 Ezt a problémát ditiotreitol/ditionit hozzáadásával oldották meg a hígítási pufferben. A Caerphilly kohorszból származó eredmények (38,0±11,0SD IU/g Hb) hasonlóak egy nemrégiben publikált tanulmányhoz (36,1±6,5 IU/g Hb).32 Az utóbbi tanulmány azonban nagyon kis számú (n=10) szívinfarktusos betegen alapult. A Caerphillyi kohorszban mért átlagos katalázaktivitás hasonló volt egy korábbi, bár sokkal kisebb laboratóriumunkban végzett vizsgálathoz30 , amelyben 50-54 éves férfiak egy csoportját vizsgálták (52,9±17,1, illetve 49,0±20 K/g Hb, n=18), akik viszont magasabb katalázaktivitást mutattak, mint egy jóval korábbi vizsgálatban (31. táblázat).3±9,6 K/g Hb).33 A használt G-6-PDH-készlet gyártója 1,31±0,13 (átlag±SD) U/gHb “normális” értéket ad meg, ami összehasonlítható az ebben a vizsgálatban kapott 1,32±0,7 U/g Hb eredménnyel.

Az akut fázis fehérjék a betegség markerei. Az ebben a vizsgálatban mérteket pozitív akut fázisú fehérjéknek nevezik (azaz betegségben megnövekednek). Mind az alfa-1-antichymotripszin, mind a caeruloplasmin (fehérje) átlagos szintje a korábban megállapított referenciatartományba34 (0,3-0,6, illetve 0,15-0,6 g/l) esett. Megállapították továbbá, hogy ezek az értékek összehasonlíthatóak az EPIC-vizsgálat brit ágának egyik kohorszában mért értékekkel,35 míg a caeruloplazmin-oxidáz aktivitás hasonló volt egy 1994-es vizsgálatéhoz.36 A 3. táblázat azt mutatja, hogy a vér antioxidáns enzimjei összességében alig változtak az életkorral. A várakozásoknak megfelelően az akut fázisú fehérjék (a gyulladásos állapot mérőszáma) pozitív kapcsolatban álltak az életkorral. Mindkét akut fázisú fehérje szignifikáns pozitív összefüggést mutatott a dohányzási szokásokkal. Csak a GPX mutatott szignifikáns (negatív) összefüggést a dohányzási szokásokkal. Korábban kimutatták, hogy az eritrociták GPX-aktivitása alacsonyabb a dohányosoknál, mint a nemdohányzóknál,37 ami valószínűleg azt a fokozott oxidatív stresszt tükrözi, amely a füstben jelen lévő szabad gyökök miatt feltételezhetően ebben a csoportban jelentkezik.38 A társadalmi osztályra vonatkozó eredmények a társadalmi osztály csökkenésével a gyulladásos állapot (az akut fázisú fehérjék növekvő szintje alapján) emelkedő tendenciát mutattak. A GPX volt az egyetlen enzim, amely szignifikáns összefüggést mutatott a társadalmi osztállyal, a manuális csoportban csökkent az aktivitás. A BMI hasonló mintázatot mutatott, mint a többi vizsgált életmódtényező, azonban az összefüggések nem voltak olyan erősek. Az alacsonyabb társadalmi osztályok esetében megfigyelt tendenciák és összefüggések nem voltak váratlanok, mivel a környezeti körülmények és az életmódbeli tényezők, mint például a dohányzás, a táplálkozás stb. valószínűleg hozzájárulnak a gyulladás magasabb szintjéhez és a megnövekedett BMI-hez.

Az adatok faktorelemzése háromfaktoros modellt eredményezett, amely az adatsor variációjának 65,9%-át magyarázta. A faktorelemzés számos érdekes szempontot tárt fel. A modell 1. faktora három olyan mérőszámot gyűjt össze, amelyek gyulladásos mechanizmusokon keresztül kapcsolódnak egymáshoz. A 2. faktor két “főáramú” antioxidánst tartalmaz, nevezetesen a SOD-t és a katalázt. Az a megfigyelés, hogy a 3. faktor leginkább a GPX-hez és a G-6-PDH-hoz kapcsolódik, megfelel az elmélet által megjósoltnak, mivel az utóbbi enzim redukált kofaktort termel a glutation redukciójához, amelyet viszont az előbbi enzim felhasználhat. Bizonyított, hogy a glükóz-6-foszfát a sejtek glükóz-metabolizmusának központi molekulája, amely kritikusan befolyásolja a pentóz-foszfát-ciklus aktivitását, és a NADPH-termelésen keresztül szabályozza a GPX aktivitását a gyökös méregtelenítés, valamint a koleszterin- és trigliceridszintézis szempontjából.39

A Cu Zn SOD enzim az O2–et H2O2-vá alakítja. Az eritrocita GPX nagy sebességgel képes eltávolítani a H2O2-t, és a GSH-t GSSG-vé oxidálja. A GSSG-t a G-6-PD-ből előállított NADPH redukálhatja GSH-vá. A kataláz a GPX-nél nagyobb kapacitással rendelkezik a H2O2 (amelyet többek között a neutrofilek légzésrobbanása termel) megsemmisítésére, közvetlenül H2O-ra bontva azt; a percenként és enzimmolekulánként megsemmisített H2O2 molekulák számát tekintve ez az egyik legaktívabb ismert enzim. Ugyanakkor a H2O2 iránti affinitása is alacsony, és a nagy aktivitáshoz magas H2O2-koncentrációra van szüksége, alacsony koncentrációban csak lassan birkózik meg a H2O2-vel.

A H2O2 molekula könnyen átjut a sejtmembránokon, és ha extracellulárisan keletkezik, akkor a legközelebbi sejtbe (beleértve az eritrocitákat is) diffundálhat, ahol antioxidáns enzimek által metabolizálódik. Ezért az eritrociták és más sejttípusok a H2O2 `nyelőjeként’ működhetnek. Az antioxidáns védelmi mechanizmusoknak a gyulladás (vagy oxidatív stressz) mutatóival kombinált összekapcsolódása lehet az, amit a háromtényezős modell leképez. Ez alátámasztja a vér kiegyensúlyozott, együttműködő antioxidáns védelmi rendszerének koncepcióját, amely inkább több antioxidáns rendszer optimális szintjétől függ, mint egyetlen antioxidáns koncentrációjától vagy aktivitásától, de nem zárja ki vagy csökkenti egyes antioxidánsok jelentőségét bizonyos helyzetekben vagy körülmények között.

Összefoglalva, e vizsgálat legfontosabb megállapításai az, hogy a caeruloplasmin (teljes és oxidáz) csak az alacsonyabb társadalmi osztályokban emelkedett a dohányosoknál. A caeruloplazmin változásai az akut fázisú reaktáns, az alfa-1-antichymotripszin változásaiban tükröződtek, és valószínűleg a gyulladással vagy a betegségállapottal függtek össze. A GPX volt az egyetlen antioxidáns enzim, amely szignifikánsan változott az életmóddal, és az életkorral nőtt, de alacsonyabb volt a dohányosoknál és az alacsonyabb társadalmi-gazdasági osztályokba tartozóknál, valamint az alacsonyabb BMI-vel rendelkezőknél. Összességében ezek az eredmények az oxidatív/gyulladásos stresszel párhuzamosan csökkenő antioxidáns védelmet jeleznek. A faktorelemzés egy háromfaktoros modellt eredményezett, amely az adatsor variációjának 65,9%-át magyarázta, ami az antioxidáns enzimek közötti szoros összefüggésekre látszott utalni.

.