2018. május 12.
Az egyik gyakori kérdés, amit a tudósok mindig feltesznek, amikor egy antitest alapú vizsgálatból jelet kapnak: “
Az antitestspecifikusság mindig aggodalomra ad okot a tudósok számára. Annak ellenére, hogy számos validálási módszer létezik, amelyeket a specificitás vizsgálatára használtak, az adatokat gyakran túlértelmezik. Különböző csoportok kutatási adatai azt mutatták, hogy a piacon lévő, gyakran használt monoklonális antitestek valójában nem monospecifikusak. Keresztreagálhatnak más fehérjékkel.És a keresztreaktivitás félrevezetheti a kutatókat hamis pozitív eredményekkel, és esetleg váratlan mellékhatásokat és hamis diagnosztikai jelentéseket okozhat a klinikusok számára.
Az antitestspecificitás validálásához milyen kontrollokat kell használnunk?
Az antitestek validálásához pozitív kontrollként olyan sejtvonalak és szövetek használhatók, amelyek nagy mennyiségben expresszálják a célfehérjéket.Ez lehet endogén fehérje vagy egy cDNS-klón által kódolt, felülexprimált fehérje. A pozitív kontroll azonban nem lesz képes megerősíteni az antitest specifitását. Láthat megfelelő méretű sávot vagy pozitív festődést a megfelelő szubcelluláris helyen, de ezek mind hamis pozitív jelek lehetnek az antitest keresztreaktivitásából eredő hamis pozitív jelek. Ezért az antitestek validálásához általában negatív kontrollra van szükség a nem specifikus kötődés értékeléséhez.
A knockout validálás eddig a legjobb negatív kontroll az antitestspecifikusság értékeléséhez. A knockout validáció során az antitestet olyan knockout sejtvonalon tesztelik, amely nem expresszálja a célfehérjét. 2017-től kezdődően az OriGene összefogott az EdiGene-nel, a CRISPR innovátorával, hogy nagy áteresztőképességű dupla-knockout sejteket állítson elő. A Horizon knockout sejtvonalától eltérően az OriGene knockout sejtvonalai olyan általánosan használt sejtvonalakból származnak, mint a HEK293T vagy a HeLa, így a termék relevánsabbá válik a kutatók számára.Ebben a kettős knockout sejtvonalban az antitest célpontja nincs jelen, mivel a fehérjét kódoló gén ki van iktatva vagy “kiütve”. A knockout sejtekből és a szülői sejtekből (vad típusú sejtek) származó mintákat egymás mellett tesztelik ugyanazzal az antitesttel, és ha az antitest valóban specifikus, akkor csak a vad típusú sejtben kell kimutatnia a specifikus jelet, de a knockout sejtvonalban nem. A knockout sejtekből származó lizátokat felhasználva több mint 100 monoklonális antitestet validáltunk (KO validált antitestek). Úgy véljük, hogy a knockout validáció valódi negatív kontrollt nyújt az antitestspecifikusság teszteléséhez.
De vajon a knockout validáció elegendő-e egy antitest monospecifikusságának megerősítéséhez? Először is, a knockout sejtek célponton kívüli hatásai jelenleg nem jól tanulmányozottak. Tehát előfordulhat, hogy egy knockout sejt nem csak a kívánt fehérje kifejeződését szünteti meg, hanem egy másik fehérje kifejeződését is megszünteti vagy csökkenti, amely lehet, hogy az antitesttel keresztreagáló fehérje. Tehát a negatív jel nem mindig jelenti azt, hogy az antitest nem lép reakcióba más fehérjékkel, kivéve az érdeklődésre számot tartó fehérjét. Másodszor, a knockout sejtekkel/szövetekkel végzett vizsgálat csak a nem esszenciális fehérjék esetében lehetséges. Az esszenciális fehérjék esetében a knockout lehetetlen. Így ezekre a fehérjékre más módszerre van szükség az antitest specificitásának tesztelésére.
Néhány évvel ezelőtt az OriGene kifejlesztett egy fehérje array módszert az antitest specificitásának tesztelésére. A világ legnagyobb overexpressziós lizátumgyűjteményével egy egyedülálló fehérjechipet készítettünk, amely >10k felülexprimált emberi fehérjét tartalmaz duplikátumban egyetlen nitrocellulózzal bevont üveglemezen. Ezt a proteinmicroarray technológiát számos OriGeneUltraMAB™ monoklonális antitest specifitásának validálására használtuk. A chipen lévő fehérjék számának növelésével az antitest keresztreaktivitása a teljes humán proteaszómára kiterjedően tovább vizsgálható.
Összefoglalva, az antitestek specificitásának vizsgálata meglehetősen bonyolult. Több eszközzel és irányban kell validálni.Ahogy a technológia tovább fejlődik, egyre több értékes eszközzel és szabványosított eljárással rendelkezünk majd az antitestek validálásához.A tudósok nem fognak ugyanazzal a kérdéssel szembesülni, amikor pozitív jeleket kapnak az antitest alapú tesztjeikből.