Búza aleuronból és korpából származó vízzel extrahálható arabinoxilán antiglikémiás hatása

Abstract

Az arabinoxilán (AX) poliszacharidok posztprandiális glükózválaszra gyakorolt hatásainak vizsgálata az AX szerkezetének változatossága miatt ellentétes eredményeket hozott. Négy vízzel extrahálható AX (WEAX) kivonatot használtunk, amelyeket búza aleuronból és korpából nyertünk, hogy megvizsgáljuk (a) az AX hatását az α-amiláz és α-glükozidáz aktivitására, (b) az AX kémiai összetételének hatását gátló hatásukra, és (c) az enzimgátlás kinetikáját. Az α-Amiláz aktivitást a WEAX frakciók jelenléte nem befolyásolta szignifikánsan, függetlenül azok típusától vagy koncentrációjától. A WEAX csak akkor gátolta az α-glükozidáz aktivitást, ha maltózt használtak szubsztrátként, szacharózt nem. A WEAX IC50 értékei (- mg/ml) erősen korreláltak a ferulasavtartalommal (), az arabinóz és xilóz arányával (), valamint a szubsztituálatlan (), a diszubsztituált () és a monoszubsztituált () xilóz relatív arányával. A Lineweaver-Burk-diagram nem kompetitív enzimgátlási módra utalt. Így eredményeink arra utalnak, hogy a WEAX antiglikémiás tulajdonságai az α-glükozidáz aktivitás közvetlen gátlásából származhatnak.

1. Bevezetés

A 2-es típusú cukorbetegség előfordulási gyakorisága világszerte növekszik. A cukorbetegség krónikus betegség, amelyet a magas keringő plazma glükózzal jellemez. Ezért a posztprandiális glükóz kezelése kritikus jelentőségű a 2-es típusú cukorbetegek megelőzésében és kezelésében. Humán intervenciós vizsgálatok kimutatták, hogy az arabinoxilánban (AX) gazdag étrend fogyasztása mérsékli a posztprandiális vércukorszintet egészséges, csökkent glükóztoleranciájú és cukorbeteg alanyoknál. Ezzel szemben Mohlig és munkatársai nem találtak hatást a glükózválaszra, amikor egészséges emberi alanyokat AX-szel kiegészített zsemlével etettek. Állatkísérletek szintén vegyes eredményekről számoltak be az AX-kiegészítés hatásáról . A mögöttes mechanizmusok továbbra is tisztázatlanok, de állítólag az oldható rostok növelik a lumen viszkozitását, ezáltal késleltetik a tápanyagok felszívódását . Az AX-oldatok látszólagos viszkozitását befolyásolja az AX-ek aszimmetrikus konformációja és molekulatömege, valamint a polimer koncentrációja . E három tényező közül úgy tűnik, hogy az AX koncentrációja befolyásolja leginkább a viszkozitást . Így az AX-ek vércukorszintre gyakorolt hatása dózisfüggő. Az AX-oldatok látszólagos viszkozitása a nyírófeszültségtől is függ, így a nagyobb nyírás nyírási elvékonyodást eredményez, ami a nem-newtoni folyadékokra jellemző viselkedés. A legújabb vizsgálatok szerint az AX viszkozitási hatását ellensúlyozhatja az erős bélperisztaltika.

Az AX molekulaszerkezete összetett és heterogén. Az AX-ek a xilángerincből állnak, amely () kötött β-D-xilopiranozil (Xylp) maradékokból áll, α-L-arabinofuranozil (Araf) maradékokkal, amelyek C(O)-2 és C(O)-3 és/vagy C(O)-2 és C(O)-3 pozíciókban kapcsolódnak a xilángerinchez . A xilózmaradványok helyettesíthetők glükuronsav és/vagy metilglükuronsav kötésekkel is . A ferulasav- vagy kumársav-maradékok a C(O)-5 helyzetben észterkötéssel kapcsolódnak az arabinóz-maradékokhoz . Az arabinóz és a xilóz aránya, az arabinóz-szubsztitúció mintázata, a feruloilezés mértéke és a molekulatömeg nagymértékben változik a gabonaszemek között és azokon belül is. Az arabinoxilánok (AX) alkotják a gabonaszemek élelmi rostjainak legnagyobb részét (60-70%), és tartalmuk a forrástól vagy a gabona frakciójától függően változik. Az AX a búza 1,3-2,7 tömegszázalékát teszi ki. A búza aleuronja és perikarpája 20, illetve 45% AX-et tartalmaz. A búzában lévő AX-ek nagy része vízben nem oldódik (70-86%) .

A táplálékkal emészthető szénhidrátok a gyomor-bél traktusban történő felszívódásuk előtt monomer cukrokká, glükózzá vagy fruktózzá hidrolizálódnak . A keményítőt elsősorban a nyál és a hasnyálmirigy amiláz emészti maltózzá és más rövid szénhidrátokká. Az így keletkező (maltóz, maltotrióz és α-határ-dextrinek) és szacharózt a vékonybél kefekötő α-glükozidázai (maltáz-glükoamiláz és szukráz-izomaltáz) emésztik glükózzá vagy fruktózzá . A cukor felszívódása a vékonybélben elsősorban a GLUT2, GLUT5 és SGLT1 transzporterek segítségével történik . Így a posztprandiális hiperglikémia csökkenése a bélben történő szénhidrátemésztés vagy -felvétel korlátozásával érhető el. Az AX szerkezetének óriási különbségei ellenére a legtöbb tanulmány nagyon kevés vagy semmilyen részletet nem közöl a felhasznált AX összetételéről vagy szerkezetéről, ami megnehezíti az AX posztprandiális vércukorszintre gyakorolt hatására vonatkozó eredmények összehasonlítását. Nagyon korlátozott adatok állnak rendelkezésre a tisztított vízzel extrahálható AX-ek szénhidrát-emésztő enzimekre gyakorolt hatásáról is. Ezért ebben a tanulmányban célul tűztük ki (a) az AX hatásának vizsgálatát az α-amiláz és az α-glükozidáz aktivitására, (b) az AX kémiai összetételének hatását a gátló hatásukra, és (c) az enzimgátlás kinetikáját.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Az AX hatása az α-amiláz és az α-glükozidáz aktivitására. Vegyszerek és reagensek

A kereskedelmi búza aleuron (Grainwise búza aleuron) a Cargill Limited és a Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA) ajándéka volt. Ez 4,5, 15,2, 7,4 és 2,5% lipidet, fehérjét, hamut és keményítőt tartalmaz. A kemény vörös őszi búzakorpát helyben vásárolták a Bulk Barn-tól (Winnipeg, Manitoba, Kanada). Nedvesség-, hamu- és fehérjetartalmát 5,8, 5,3, illetve 11,1%-ra elemezték. A búzából származó nem módosított keményítőt, maltózt, szacharózt, akarbózt, sertés hasnyálmirigyből származó α-amilázt (EC 3.2.1.1, VI-B típus), aszpergillusból származó amiloglükozidázt (EC 3.2.1.3) és patkányok bélacetonporát a Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA) cégtől vásároltuk. Ammónium-szulfátot, minden savat és szerves oldószert a Fischer Scientific-től (Whitby, Ontario, Kanada) vásároltunk. A maltóz, szacharóz és glükóz vizsgálati készletet (K-MASUG 08/13) a Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Írország) cégtől vásároltuk. Minden felhasznált vegyszer analitikai vagy HPLC minőségű volt.

2.2. Vízzel extrahálható arabinoxilán előállítása

Az endogén enzimeket úgy inaktiváltuk, hogy búzakorpa és búza aleuron mintákat (~200 g) 2 L vizes etanolban (80%, v/v) 85°C-on, reflux alatt 2 órán át forralva forraltuk. A felülúszót elvetettük, és a maradékot egy éjszakán át szobahőmérsékleten, füstölőben levegőn szárítottuk. A levegőn szárított korpából vagy aleuronból (150 g) 45°C-on vízzel extrahálható frakciókat izoláltunk az Izydorczyk és Biliaderis által leírt módszer szerint. A vizes kivonatot α-amilázzal (1821 U/L) keményítetlenítettük, majd celittal és telérfölddel fehérjétlenítettük. A megtisztított anyagot fokozatos ammónium-szulfát (AS) kicsapással frakcionáltuk, és a frakciókat 50 és 75%-os AS-telítettségnél kaptuk. Az összegyűjtött anyagot fagyasztva szárítottuk, miután 48 órán keresztül dializáltuk (12 kDa cut-off membrán). A búza aleuronból gyűjtött, vízzel extrahálható frakciókat megjelöltük (WA), majd az AS koncentrációját, amelynél azokat nyertük (WA-f50 és WA-f75). Hasonlóképpen, a búzakorpából gyűjtött anyagokat (WB) WB-f50 és WB-f75 jelöléssel jelöltük. A WEAX frakciók kémiai és szerkezeti leírását az 1. táblázat tartalmazza.

2.3. táblázat. Az α-Amiláz aktivitás gátlási vizsgálata

A búzakeményítőt (300 mg) 15 ml nátrium-foszfát pufferben (pH 6,9, 0,1 M), amely 1 mM kalcium-kloridot tartalmazott, 15 percig 95°C-on főztük . A WEAX frakciókat (40 mg) 2 mL nátrium-foszfát pufferben oldottuk fel. A mintákat úgy hígítottuk, hogy a reakcióelegyben a végső koncentráció 0,0, 0,2, 0,3 és 0,5% (w/v) legyen. A keményítő és a WEAX (vagy kontroll) egyenlő térfogatú (200 μL) keverékét összekevertük és vortexeltük. A keményítő hidrolízisét 70 μL sertés hasnyálmirigy α-amiláz (130 U/ml) és 40 μL gombás amiloglükozidáz (240 U/ml) hozzáadásával indítottuk el. A reakciót 30 perc után 5 percig 95 °C-on történő melegítéssel állítottuk le. Az elegyet azonnal jégen lehűtöttük és centrifugáltuk (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Németország). A felülúszókat összegyűjtöttük és Megazyme glükóz tesztkészlet segítségével glükózra analizáltuk. A humán intervenciós vizsgálatok 0,25-0,70%-os AX-koncentráció hatékonyságáról számoltak be, ezért választottuk a koncentrációtartományt.

2,4. Patkányok bélrendszeri α-glükozidáz aktivitásának gátlási vizsgálata

Az Oki és munkatársai által alkalmazott α-glükozidáz gátlási módszert használtuk módosításokkal. Röviden, patkánybél acetonport (500 mg) 10 ml nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,9, 0,1 M) kevertünk, és jégfürdőben 30 másodpercig (12 alkalommal) szonikáztuk, 15 másodperces szünettel a hőfelhalmozódás megelőzése érdekében. Az elegyet később 10 percig 10000-nél, 4°C-on centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük és patkány bélrendszeri α-glükozidázzal jelöltük. A WEAX-mintákat (40 mg) 2 ml nátrium-foszfát pufferben (pH 6,9, 0,1 M) oldottuk fel. Később 50 μL patkánybél α-glükozidázt kevertünk 100 μL mintával vagy pufferrel (kontroll), és 5 percig 37°C-on inkubáltuk. Ötven μL 20 mM szacharózt vagy 4 mM maltózt adtunk hozzá, és tovább inkubáltuk 60 percig (szacharóz) vagy 30 percig (maltóz). A WEAX-frakció végső koncentrációja 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 és 0,0% (w/v) volt. Az enzimaktivitást 10 percig 95°C-on történő melegítéssel állítottuk le. A 10 percig tartó 10000-es centrifugálást követően a felülúszókat összegyűjtöttük a Megazyme GOPOD glükóz tesztkészlet segítségével végzett glükózelemzéshez. Az alfa-glükozidáz (szukráz vagy maltáz) gátlási %-ot a következőképpen számoltuk ki: . Az IC50-értéket az α-glükozidáz %-os gátlásának és a mintakoncentrációnak a grafikonjából határoztuk meg. A patkányok bélrendszeri α-glükozidázának akarbózzal (ismert α-glükozidáz inhibitor) történő gátlását is elvégeztük az összehasonlítás céljából. A minta helyett 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 és 13 μg/ml akarbóz koncentrációt használtunk.

2,5. Statisztikai elemzés

Minden elemzést szextuplikátumban végeztünk (hacsak másképp nem jeleztük), és minden statisztikát egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) számoltunk JMP 12 statisztikai szoftverrel (SAS Institute Inc., Cary, NC). A minták átlagait Tukey HSD módszerrel hasonlítottuk össze, és a szignifikáns különbségeket . A paraméterek közötti korrelációkat Pearson korrelációs teszt segítségével számoltuk ki.

3. Eredmények és megbeszélés

A WEAX hatásait a keményítő hidrolízisére az 1. ábra mutatja be. Összehasonlítottuk az α-amilázzal történő 30 perces inkubáció során felszabaduló glükóz mennyiségét a WEAX frakciók jelenlétében vagy hiányában. A WEAX frakciók hozzáadása számszerűen csökkentette a termelt glükóz mennyiségét a kontroll kezeléshez képest. A kezelési csoportok és a kontroll statisztikai összehasonlítása azonban azt mutatta, hogy az átlagos különbség nem volt szignifikáns () a WA-f50, WA-f75 és WB-f75 esetében, függetlenül a WEAX-koncentrációtól. A 0,5%-os WB-f50 jelenléte a kontrollhoz képest szignifikáns csökkenést eredményezett az amilolízisben (). Az alfa-amiláz aktivitásra vonatkozó megfigyeléseink azonban ellentétben álltak más irodalmi jelentésekkel, ami valószínűleg az AX koncentrációjának és típusának köszönhető. A keményítő amilolízisét 1 és 2%-os AX jelenlétében végeztük, és az alkalmazott AX nem tartalmazott ferulasavat . Az AX koncentrációját (~5-10 g) a humán vizsgálatokban a posztprandiális vércukorszint csillapításáról beszámoltakkal megegyező koncentrációban használtuk .

1. ábra

Vízzel extrahálható arabinoxilán hatása a keményítő hidrolízisére.

A 2. táblázat a WEAX hatását mutatja az α-glükozidáz aktivitásra szacharóz vagy maltóz mint szubsztrát jelenlétében. Az adatok IC50-ben vannak feltüntetve, amely az inhibitor azon koncentrációja, amely az α-glükozidáz aktivitás 50%-os gátlását eredményezi. Az IC50 értékek 4,88-10,14 mg/ml között mozogtak az α-glükozidáz aktivitás ellen maltózzal mint szubsztráttal. Szacharóz szubsztrátként történő alkalmazásakor azonban nem tapasztaltak gátlást. A WEAX gátló hatása az intestinális maltázzal szemben 1000-2000-szer kisebb volt az akarbózhoz (pozitív kontroll) képest. Széles körben feltételezik, hogy a viszkozitás lehet az oka az AX posztprandiális glükózra gyakorolt hatásának . Ezért Vogel és munkatársai módosított búzakorpa AX-et etettek patkányokkal, hogy tanulmányozzák a viszkozitás hatását . A bélrendszeri alfa-glükozidáz AX mono-/oligoszacharidok általi gátlását is a ferulasav-részükkel hozták összefüggésbe . Ezért a WA-f50 és a WB-f75 jelentősen eltérő gátlóerővel rendelkezett az α-glükozidáz aktivitással szemben, annak ellenére, hogy a szubsztituálatlan (un-Xylp), monoszubsztituált (2-Xylp vagy 3-Xylp) és diszubsztituált xilózmaradékok (2,3-Xylp) és a szubsztitúció mértéke hasonló relatív arányban volt jelen, de eltérő ferulasavtartalommal.

α-Glükozidáz aktivitás (IC50) Arabinóz/xilóz arány Ferulasav tartalom Unsub-Xylp Mono-Xylp a C (O)-32 Mono-Xylp a C (O)-32 Mono-Xylp a C (O)-3 Mono-Xylp összesen Di-Xylp Molekulatömeg 0.23 Uronsav 0.36

Az adatok Pearson korrelációs együttható értékeket jelentenek . un-Xylp: szubsztituálatlan xilózmaradékok, mono-Xylp: monoszubsztituált xilózmaradék, di-Xylp: C (O)-2 és C (O)-3 diszubsztituált xilózmaradványok.

3. táblázat

Az arabinoxilánok α-glükozidáz aktivitás gátlásának és szerkezeti tulajdonságainak korrelációs együtthatója.

Az arabinóz és a xilóz aránya a szubsztitúció mértékegysége (DS). Erős negatív lineáris összefüggést ( = -0,67) figyeltek meg a DS és az IC50 között. Ez az AX megnövekedett oldhatóságának következménye lehetett a magas DS miatt. Úgy tűnik tehát, hogy a magasan szubsztituált WEAX alacsonyabb IC50-értékkel rendelkezik (magas gátlóerő). Ugyanezt a megfigyelést támasztotta alá a gátlóerő és a szubsztituálatlan xilózmaradékok relatív aránya közötti negatív összefüggés. A látszólagos di-Xil és mono-Xil maradékok aránya nem tűnt befolyásoló tényezőnek, de a xilóz szubsztitúció mértéke hatást mutatott. Így valószínű, hogy az α-glükozidáz aktivitásra gyakorolt hatás a WEAX arabinózmaradványaiból eredhet. Az arabinóz α-glükozidáz aktivitást gátló hatásáról már beszámoltak. A hipotézis bizonyítására tett kísérletek az arabinózmaradványok eltávolítására a WEAX-ből arabinofuranozidázzal nem jártak sikerrel. Megállapítottuk azonban, hogy a C (O)-2 mono-Xil jelentős meghatározó volt a C (O)-3 mono-Xilhez képest, ami arra utal, hogy a gátló hatás túlmutat az arabinózmaradék puszta jelenlétén. Erős korreláció volt a C (O)-2 mono-Xil és a ferulasavtartalom között ( = 0,99). Így lehetséges, hogy a DS megfigyelt hatása a ferulasav hatásából eredhetett.

A Lineweaver-Burk-diagramot (2. ábra) használtuk a maltózzal szembeni α-glükozidáz aktivitás látszólagos maximális sebességének () és Michaelis-Menten-állandójának () kiszámítására a WEAX jelenlétében és hiányában. A WEAX frakció hatását és elemeztük, hogy meghatározzuk a gátlás típusát. és α-glükozidáz maltózra a WEAX frakciók hiányában 17,5 μg glükóz percenként, illetve 5,99 mM volt. A 4. táblázat azt mutatja, hogy a WEAX-frakciók hozzáadása mindkét értéket csökkentette, ami arra utal, hogy a WEAX nem kompetitív módon gátolta az α-glükozidáz aktivitást. A nem kompetitív gátlás tipikus jellemzője, hogy mind és és csökken az inhibitor jelenlétében. Így valószínűsíthető, hogy a WEAX frakciók kötődnek az enzim-szubsztrát komplexhez, ezáltal csökkentve mind és . Az arabinóz szintén nem kompetitív módon gátolja az α-glükozidáz aktivitást.

Eredményeink magyarázatot adhatnak az AX posztprandiális glükózszintre gyakorolt hatásával kapcsolatban az irodalomban megfigyelt következetlenségre. A Zuker-diabéteszes patkányok AX-szel (Ara/Xyl = 0,9) kiegészített kenyérrel történő etetése a posztprandiális vércukorszint szignifikáns csökkenését eredményezte . Ezzel szemben a natív AX (Ara/Xyl = 0,5) bevitele nem volt hatással a vércukorszintre adott válaszra . Az étrend 6 és 12 g AX (Ara/Xyl = 0,66 vagy 0,8) kiegészítése szintén csökkentette a vércukorszintet egészséges és cukorbeteg alanyoknál egyaránt . Az AX (Ara/Xyl = 0,8) azonban nem csökkentette a posztprandiális glükózválaszt egészséges emberi felnőtteknél . Az AX-szel kiegészített fehér kenyérrel táplált sertéseknél a fehér kenyérrel táplált sertésekhez képest csökkent a nettó glükózáramlás . A részletes kémiai összetétel és szerkezet hiánya megnehezíti az AX hatékonyságára vonatkozó eredmények összehasonlítását. Így annak ellenére, hogy a felhasznált AX-ek koncentrációja azonos lehet, a hatékonyság a felhasznált AX-ek jellegétől függ. Kimutattuk, hogy az 50%-os ammónium-szulfát telítettséggel kapott AX nagyobb gátló hatást mutatott, mint a 75%-os telítettséggel kapott AX.

4. Következtetés

A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az arabinoxilánok antiglikémiás hatása a bél α-glükozidáz aktivitás gátlásából származhat, de nem az amiláz aktivitásból. A vízzel extrahálható AX α-glükozidáz aktivitásra gyakorolt hatását befolyásolta a ferulasavtartalom arabinóz és xilóz aránya és a xilóz szubsztitúció mintázata. Az eredmények arra is utalnak, hogy az α-glükozidáz aktivitás gátlása nem kompetitív mechanizmuson keresztül történik. Így a vízzel kivonható AX-ben gazdag étrend fogyasztása mérsékelheti a posztprandiális vércukorszintet.

Tájékoztatás

Az eredmények egy részét szóbeli poszterként mutatták be a Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP) Symposium/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB) konferencián, amelyet a St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre-ben tartottak 2016. április 20-tól április 22-ig.

Érdekütközések

A kapott pénzeszközök vagy anyagi támogatás nem vezetett összeférhetetlenséghez a kézirat közzététele során.

A köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a Kanadai Természettudományi és Műszaki Kutatási Tanács (NSERC) finanszírozta a Discovery Grant Programon keresztül. A szerzők hálásak továbbá a Cargill Limitednek a búza aleuron minták biztosításáért, valamint Ce Zhou-nak, Alison Ser-nek és Pat Kenyon-nak a Manitobai Egyetem Élelmiszertudományi Tanszékéről a technikai támogatásért.