Baktericidal activity of green tea extracts: the importance of catechin containing nano particles

Bioactivity Testing- Anti-Streptococcal activity

A három különböző zöld teát és azok 5000 rpm, 10000 rpm és 20000 rpm fordulatszámon nyert kivonatait és részecskéit vizsgálták antibakteriális tulajdonságaikra a S.mutans nevű fogászati kórokozóval szemben. Annak érdekében, hogy optimalizáljuk a zöld tea kivonat koncentrációját a további kísérletekhez, hat különböző koncentrációt (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL és 500 μL) vizsgáltunk a GT-0 (részecske eltávolítása nélkül) és a GT 1, GT 2 és GT 3 5K-S koncentrációjából az S. mutans ellen. A 2. ábra mutatja a vizsgálat eredményeit. Amint a 2. a) ábrán megfigyelhető, a spektrofotometriás módszer azt mutatta, hogy a GT-0 és az 5K-S esetében mindhárom zöld tea esetében az antistreptococcus aktivitás a koncentráció növekedésével nőtt. A 300 μl-es koncentráció optimális antimikrobiális aktivitást mutatott, és ezért az összes többi kísérletben optimális koncentrációnak bizonyult ebben a vizsgálatban. Így mostantól kezdve minden kísérletet a zöld tea változók 300 μL koncentrációjával végeztünk. A 2. b) ábra az összes életképes egyedszám módszerrel végzett antimikrobiális értékeléssel kapott eredményeket mutatja. A lemezszámlálás eredményei korreláltak a spektrofotométeres zavarossági mérések esetében megfigyelt eredményekkel. Egy másik érdekes megfigyelés, amelyet ezekből az eredményekből megfigyeltünk, az antimikrobiális aktivitásnak a részecskék 5000 fordulat/perc (5K-S) eltávolításakor megfigyelt csekély mértékű javulása a GT-0-hoz képest. A GT 1-0-hoz képest a GT 1-5K-S fokozott antibakteriális aktivitást mutatott, hasonlóan a GT 2 és GT 3 esetében is. Továbbá a GT 3 mutatta a legnagyobb antibakteriális aktivitást, a GT 1 pedig a legkisebb antibakteriális aktivitást.

Mivel a részecskék eltávolítása a zöld teából változásokat mutatott a zöld tea kivonat bioaktivitásában, javasoltuk, hogy részletes vizsgálatot végezzünk e hatás tanulmányozására. Szisztematikus háromlépcsős centrifugálási eljárást végeztek 5000 rpm, 10 000 rpm és 20 000 rpm fordulatszámon, amelynek célja a legnagyobb, a kisebb és a még kisebb részecskék elkülönítése volt a kivonatból. A nagy részecskéktől (5K-S), a kis részecskéktől (10K-S) és a finom részecskéktől (20K-S) megszabadított kivonatot, valamint a részecskéket (5K-P, 10K-P és 20K-P) az S. mutans-szal való kölcsönhatásuk és egyedi antibakteriális aktivitásuk szempontjából vizsgáltuk. A 3. ábra a vizsgálat eredményeit mutatja be. Amint a 3. ábra (a-1, a-2) megfigyelhető, mind a zavarosságon alapuló módszer, mind a lemezszámlálási módszer megerősítette, hogy a GT 1 tekintetében az 5K-P eltávolítása a GT 1-0-hoz képest a kivonat (5K-S) antibakteriális aktivitásának fokozódását (marginális fokozódását) eredményezte. A 10K-P eltávolítása nem eredményezett további fokozódást, és a 10K-S általában az 5K-S aktivitáshoz hasonlónak bizonyult. A 20K-P eltávolítása azonban a 20K-S antimikrobiális aktivitásának egyértelmű csökkenését eredményezte. Ez a megfigyelés a GT 2 (3. ábra (b-1,b-2)) és a GT 3 (3. ábra (c-1,c-2)) esetében volt nyilvánvaló. Bár a tendencia különböző mértékben változott a GT 1-től a GT 2-től a GT 3-ig, de az a tény, hogy a nagy zöld tea részecskék eltávolítása a kivonatból marginálisan növelte a zöld tea kivonat antibakteriális tulajdonságát, és hogy a kisebb zöld tea részecskefrakciók kiirtása a kivonatból a zöld tea antibakteriális aktivitásának egyértelmű csökkenéséhez vezetett, továbbra is megkérdőjelezhetetlen.

Mindamellett fontos itt hangsúlyozni, hogy sem az 5K-P, sem a 10K-P, sem a 20K-P részecskék nem mutattak a kivonatoknál magasabb fokozottabb önálló antibakteriális aktivitást. Az 5K-P részecskék nulla antibakteriális aktivitást mutattak, a 10K-P korlátozott mértékű antibakteriális aktivitást mutatott, míg a 20K-P-k némi aktivitást mutattak a másik két ellenfél között.

A fogászati baktérium valós idejű vizsgálata

A zöldtea-kivonatoknak a zöldtea-részecskék bioaktivitásában rejlő eltérések valós idejű rendszerekben történő értékeléséhez a kivonatokat öt különböző emberi önkéntesből származó fogászati biofilm valós mintáival állították szembe. A GT 1, GT 2 és GT 3 GT 0, 5K-S és 20K-S értékeit vizsgálták. A 4. ábra a lemezszámlálási módszert követő összes életképes baktériumszámot mutatja, amely a zöld tea kölcsönhatását túlélő baktériumokat jelzi. Érdekes volt megfigyelni, hogy a minta összetettsége ellenére a GT 0-hoz képest az 5K-S fokozott antibakteriális aktivitást mutatott, míg a 20K-S csökkent antibakteriális aktivitást mutatott mindhárom zöld teához képest.

A sejtek fluoreszcens képalkotása akridin-narancs használatával, segíti az élő/halott sejtek vizualizálását és megkülönböztetését a kezelés után. Az öt önkéntesből származó fogászati biofilmmintákat a GT 0, 5K-S és 20K-S, valamint a kontrollal való kölcsönhatás előtt és után leképeztük. Az 5. ábra mutatja a fluoreszcencia eredményeket, amelyek a zöld tea változók hatását mutatják az 1. önkéntes (A), a 2. önkéntes (B), a 3. önkéntes (C), a 4. önkéntes (D) és az 5. önkéntes (E) esetében. Amint az 5. ábra (a) ábráján megfigyelhető, az A, B, C, D és E kontrollképek túlnyomórészt narancssárga fluoreszcenciát mutatnak, ami az aktívan metabolizáló élő fogbaktériumok jelenlétére utal. A képen megfigyelhető, hogy a fogakról levált biofilm megtartotta biofilm-azonosságát, és a kontroll esetében mikrobiális szőnyegként jelenik meg. A GT 0 kezelés minden önkéntes esetében a zöld teától elvárt, jól várt pusztító hatást eredményezte (5. ábra (b)). A zöld fluoreszkáló területek (elhalt sejtek) domináltak, amelyek között narancssárga fluoreszkáló területek léteztek. A (c) panel a GT 3 5K-S felülúszójából származó eredményeket ábrázolja, ahol a legnagyobb zöld tea részecskéket eltávolítottuk a kivonatból. Ahogy a fluoreszcencia-mikroszkópos felvételeken megfigyelhető, nem volt megfigyelhető narancssárga fluoreszcencia, és teljes zöld fluoreszcencia jelezte a fogbaktériumok/biofilm teljes megsemmisülését. Szintén érdekes volt megfigyelni, hogy nem voltak többé biofilm foltok vagy szőnyegek megfigyelhetőek, a biofilm szőnyegek felbomlottak, és minden vizsgálati mintában (A(c), B(c), C(c), D(c) és E(c)) csak elszórt sejtcsomók voltak láthatók. Végül az 5. ábra (d) a 20K-S kölcsönhatás eredményeit mutatja, a zöldtea-kivonat ölő hatásának jelentős csökkenése nyilvánvaló. A narancssárgán fluoreszkáló élő baktériumsejtek megjelenése a kivonat antimikrobiális aktivitásának csökkenését jelzi a nano zöldtea komponensek eltávolításakor. Bár zöld fluoreszkáló halott sejtek is megfigyelhetők, az élő/halott sejtek aránya megváltozottnak tűnik. Ezek az eredmények megerősítették a spektrofotometriás módszerrel és a lemezszámlálási módszerrel jelentett tendenciát a különböző vizsgált zöld tea komponensek antimikrobiális aktivitásáról.

FE-SEM megfigyelés a kontroll és az 5K-S kölcsönhatásban lévő fogbaktériumokról a 6. ábrán (a-c) látható. Az ábrán megfigyelhető, hogy a kontroll (6. ábra (a)) jól fejlett biofilmet mutat (4. önkéntes), míg a GT 0 (6. ábra (b)) a GT 3 és az 5K-S (6. ábra (c)) kölcsönhatása a sejtek és a biofilm károsodását eredményezte, amit a sejttörmelék jelez. A CLSM segítségével rögzített képek (d) azt mutatják, hogy mind az öt önkéntesből származó fogbaktériumok túlnyomó többségét elpusztította a GT 3 (5K-S). A GT 3-GT 0 és az 5K-S bizonyult a legígéretesebbnek az összes önkéntes fogbaktériumával szemben.

A kivonat és a részecskék jellemzése

Mivel a zöld tea összetevőinek antibakteriális aktivitásán alapuló bioaktivitási vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a zöld tea részecskék jelenléte és hiánya valóban megváltoztatja a kivonat aktivitását, szükséges a három zöld tea GT 0, 5K-S, 10K-S és 20K-S kivonatainak, majd 5K-P, 10K-P és 20K-P részecskéinek részletes jellemzése.

Biokémiai jellemzés

Az antibakteriális aktivitást általában az összes fenol, a flavanoidok és a kivonat antioxidáns képessége határozza meg. Mindezen paramétereket vizsgáltuk és összehasonlítottuk a jelen tanulmányban alkalmazott kivonatok és részecskék között. A 7. a) ábra a GT 1 esetében kapott eredményeket mutatja, a flavanoidok esetében a grafikonon látható, hogy a GT 0, 5K-S, 10K-S és 20K-S kivonatok között nem sok különbség volt megfigyelhető a flavanoidtartalomban, a GT 0 a többihez képest marginális növekedést mutatott. A zöld tearészecskék esetében azonban az 5K-P mutatta a legmagasabb flavanoidtartalmat, a 10K-P és a 20K-P pedig a kivonatokban talált flavanoidtartalomhoz hasonló tartományban követte őket. A GT 2 7. ábra (b) és GT 3 7. ábra (c) esetében a flavanoidtartalom eltérő volt, az 5K-S és 10K-S kivonatok mutatták a legmagasabb flavanoidtartalmat a GT 0-hoz képest. Az 5K-P és 10K-P részecskék nagyon alacsony flavanoidtartalmat mutattak. Kivételt képeztek a 20K-S kivonatok, amelyek a többi kivonathoz képest kevesebb flavanoidot mutattak, a 20K-P részecskék pedig a többi részecskéhez képest magasabb flavanoidtartalmat mutattak.

Az összes fenolok tekintetében a GT 1-ben a legmagasabb értéket a GT 0-ban találtuk, míg a többi kisebb értékeket mutatott. A GT 2 és GT 3 esetében azonban ismét hasonló tendencia volt megfigyelhető a fenoltartalom esetében, ahol minden kivonat közel hasonló fenoltartalmat mutatott. Az 5K-P és a 10K-P azonban a 20K-P-hez képest a legkisebb fenoltartalmat mutatta.

Az antioxidáns aktivitás tekintetében a GT 1 kivonatok (GT 0, 5K-S, 10K-S és 20K-S) nagyon magas antioxidáns aktivitást mutattak, míg az 5K-P és a 10K-P hatszor alacsonyabb antioxidáns aktivitást mutatott. Itt kell azonban megemlíteni, hogy a 20K-P-k jelentősen magasabb antioxidáns aktivitást mutattak, mint az 5K-P és a 10K-P. A GT 2 és GT 3 esetében ez a tendencia még kifejezettebb volt, az 5K-S és 10K-S magasabb antioxidáns aktivitást mutatott a GT 0-hoz képest. A 20K-S esetében azonban az antioxidáns aktivitás egyértelmű csökkenése volt megfigyelhető, a GT 2 és GT 3 20K-P-jének megfelelő növekedése mellett. Meg kell jegyezni, hogy a három vizsgált zöld tea közül a GT 3 mutatott magasabb értékeket e bioaktív vegyületek tekintetében, szorosan követve a GT 2-t, és végül jelentősen lemaradva a GT 1. Ez a tendencia erősen korrelál a zöld teák antimikrobiális bioaktivitásával, amely a következő sorrendben alakult: GT 3 > GT 2 > GT1.

FE-SEM elemzés

Az 5K-P, 10K-P és 20K-P részecskéket FE-SEM segítségével ábrázoltuk morfológiai részleteik és méretük szempontjából. A 8. ábra a GT 1 (A), GT 2(B) és GT 3 (C) részecskék 5K-P (a), 10K-P (b) és 20K-P (c) morfológiáját mutatja. A legtöbb esetben szabálytalan morfológiák voltak megfigyelhetők, amelyeknek nem volt határozott alakjuk. Amint a 8. ábrán megfigyelhető, az 5K-P részecskék a GT 1 és GT 2 esetében makro méretűek voltak, ezek azok, amelyeket láthatóan látunk a csésze zöld teánkban. Az 1. táblázat a méreteiket mutatja, a GT 2 (B) 5K-P részecskék voltak a legnagyobbak (50-80 μm), őket követte a GT 1(B(a)), amelyek a 15-25 μm-es mérettartományban voltak. A GT 3 5K-P részecskék viszonylag kisebbek voltak a 6-30 μm-es tartományban (8. ábra (C(a)). Ahogy a mikroszkópiákon megfigyelhető, a részecskék nem voltak rögzített méretűek, ami az ilyen nyers, nem szabványosított kereskedelmi minták esetében várható. A 10K-P részecskék a GT 1 esetében 4-10 μm (A(b)), a GT 2 esetében 2-10 μm (8. ábraB(b)) és a GT 3 esetében 0,5-3 μm (C(b)) mikromérettartományban voltak. A 20K-P részecskék kisebb mikro- és nanoméretűek voltak, a GT 1 részecskék a 0,5-6 μm-es tartományban (A(c)), a GT 2 részecskék (B(c)) 200 nm és 540 nm között voltak, a GT 3 részecskék (C(c)) pedig a legkisebb méretűek voltak, amelyek az 50 nm-300 nm-es mérettartományban léteztek. Ahogy tehát ezek az eredmények mutatják, a 20K-P részecskék, amelyek fokozott bioaktív komponensekkel rendelkeztek, és antioxidáns és antibakteriális tulajdonságot mutattak, a közel nanoméretű tartományban voltak megfigyelhetőek.

UV-Vis spektrofotometria

A 9. ábra az EGCG-tartalom szempontjából jellemzett kivonatok és részecskék UV-Vis spektrumát mutatja. Atomsa & Gotlap 201539 közölte a katechin család abszorbanciáját: Az EGCG vízben 248-361 nm-es tartományban mutat abszorbanciát, λmax 273,6 nm-nél; az ECG 246- 363 nm λmax 276,8 nm-nél; az EGC spektrumtartománya vízben 254-378 nm és λmax 269,6 nm-nél, az EC-é pedig 252-328 nm, λmax 278,4 nm-nél. Amint a 9. a) GT-1 ábrán megfigyelhető, csak az EGCG abszorpciós csúcsát látjuk 273 nm-nél. Az EGCG-csúcs tekintetében nem volt különbség a kivonatokon belül (GT 0, 5K-S, 10K-S és 20K-S). A zöld tea részecskék esetében azonban megfigyelhető volt, hogy a 20K-P részecskéknél az EGCG intenzitása jelentősen megnőtt az 5K-P és a 10K-P részecskékhez képest. Érdekes volt megfigyelni, hogy a 20K-P-k közel 50%-ban tartalmazták a kivonatokban található EGCG-t.

A GT 2 esetében megfigyelhető volt, hogy a kivonatok a 248-363 nm-es tartományban más katechin családba tartozó csúcsok jelenlétét mutatták, amint azt a 9. ábra b) pontjában látható különböző csúcscsúcsok ebben a tartományban megfigyelték. A részecskék eltávolítása a kivonatból a csúcsok eltolódásához vezetett. Különösen a kivonatok mutattak határozott eltolódásokat. Az 5K-P és 10K-P részecskék esetében azonban megfigyelhető volt, hogy kizárólag EGCG-csúcsokat mutattak, mégpedig alacsony intenzitással. A hangsúly itt a 20K-P részecskéken van, amelyek a kivonatokhoz képest majdnem hasonló intenzitású katechin-csúcsokat mutattak. Megfigyelhető volt, hogy az 5K-P-vel és a 10K-P-vel ellentétben a 20K-P nem csak EGCG csúcsokat mutatott, hanem a többi katechin családba tartozó csúcsot is, meglehetősen hasonlóan a kivonatokhoz.

GT 3 (9. ábra (c)), a kivonatok különböző csúcsokat adtak, beleértve a katechin csúcsokat is. Azonban a GT 1 és a GT 2höz képest az 5K-P és 10K-P részecskék maguk is nagy intenzitású EGCG-csúcsokat mutattak. Az a tendencia, hogy az 5K-P és a 10K-P csak EGCG-csúcsot mutatott, a GT 3 esetében is folytatódott. Az 5K-P magasabb EGCG-t mutatott a GT-1 és GT 2 részecskékhez képest, de a GT 3 10K-P részecskékhez képest sokkal alacsonyabb volt. A GT 3 10K-P-je a kivonatokhoz hasonló EGCG-tartalmat mutatott. A 20K-P-k ebben az esetben a legmagasabb katechin-csúcsokat regisztrálták, felülmúlva a kivonatokét is. A 20K-P és a kivonatok esetében hasonló csúcseltolódások voltak megfigyelhetők, mint a vizes extrakció és az oldószeres extrakció során. Érdekes volt megfigyelni, hogy a 20K-P csúcsok keskenyebbek és nagy intenzitásúak voltak. A 20K-P-kben kivételesen magas, az EGC-nek megfelelő 269 nm-es csúcsot figyeltek meg. Azzal az általános megfigyeléssel, hogy a 20K-P-k jelentősen nagy mennyiségű katechint tartalmaztak a GT-1, GT 2 és GT 3-ban, ezek a vizsgálatok megerősítették.

FT-IR

A GT 3 5K-P, 10K-P és 20K-P részecskékből kapott FT-IR spektrumot, amely a maximális antibakteriális aktivitást és egyedi tulajdonságokat mutatta, a 10. ábra (a) mutatja. A spektrumok megegyeznek az EGCG jellegzetes sávjával. Ponnuraj et al, 201540 az EGCG ujjlenyomatát a 3357,46 cm-1 -nél az aromás gyűrűhöz kapcsolódó O-H csoport, 1691,27 cm-1 és 1616,06 cm-1 -nél a trihidroxibenzoátcsoportot és a krománcsoportot összekötő C = O csoport, 1447,31 cm-1 -nél a kromángyűrűben jelen lévő C-H csoport, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 az O-C = O csoportra, 1148,40 cm-1 az O-H csoportra, 1041,37 cm-1 a kromángyűrűt és a trihidroxi-benzoátgyűrűt összekötő C-O-C csoportra és 825,38 cm-1 az aromás gyűrűben lévő C-H csoportra. Érdekes és támogató volt megfigyelni, hogy a növekvő centrifugálás függvényében egy határozott mintázat figyelhető meg, amely megfelel a csökkenő részecskeméretnek. 5K-P-nél az EGCG-sávok intenzitása volt a legalacsonyabb, majd a 10K-P és a 20K-P sávok mutattak nagy intenzitású sávokat. Ez korrelál az UV-vizsgálatok során is megfigyelt eredményekkel.

A 10. ábra (b) a GT 1 5K-P és 20K-P részecskékből kapott FT-IR spektrumokat mutatja, A GT 1 esetében nem volt nagy különbség a két részecske EGCG-sávjai között. Ezek az eredmények megegyeznek az UV-spektrofotometriás vizsgálatoknál is megfigyelt eredményekkel. A 10. (c) ábra a GT 1, GT 2 és GT 3 20K-P összehasonlító spektrumát mutatja. Látható a megnövekedett EGCG-sávok gradiens mintázata a következő sorrendben: GT 1 < GT 2 < GT 3.

.