FOOD MICROBIOLOGY
Isolation of bacteriocin-termelő tejsavbaktériumok húsból és húskészítményekből és gátló aktivitásuk spektruma
Isolamento de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas a partir de carnes e produtos cárneos e seu espectro de atividade inibitória
Renata Bromberg; Izildinha Moreno; Cíntia Lopes Zaganini; Roberta Regina Delboni; Josiane de Oliveira
Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas, SP, Brasil
Correspondence
ABSTRACT
A “szendvics” teszt segítségével összesen 285 hús- és húskészítménymintát vizsgáltak a bakteriocin-termelő tejsavbaktériumok jelenlétére. E minták közül 174 mintából 813 tejsavbaktériumtörzset izoláltak. Ezek képesek voltak gátolni a Staphylococcus aureus CTC 33 és/vagy a Listeria innocua Lin 11 növekedését. A jól diffúziós teszttel értékelve e törzsek közül 128 gátolta az indikátor törzsek növekedését. Az izolátumok gátló hatásspektrumát számos Gram-pozitív és Gram-negatív tesztorganizmussal szemben értékelték. A S. aureus volt a legérzékenyebb vizsgált indikátor, míg az Enterococcus faecalis és a Lactobacillus plantarum volt a legellenállóbb. A tejsavbaktériumok által termelt összes vegyületet néhány proteolitikus enzim teljesen vagy részben inaktiválta, ami fehérjeszerűségükre utal. Az ebben a munkában izolált tejsavbaktériumok által termelt bakteriocinok antimikrobiális aktivitása potenciális gátként működhet a romlást okozó baktériumok és az élelmiszerrel terjedő kórokozók szaporodásának gátlásában.
Key words: bacteriocins, lactic acid bacteria, meat, inhibitory activity.
RESUMO
Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do “sanduíche”. E minták közül 174 mintából 813, a Staphylococcus aureus CTC 033 és/vagy Listeria innocua Lin 11 gátló hatású tejsavbaktériumtörzset izoláltak. A szimultán antagonizmus módszerével kutakban vizsgálva e törzsek közül 128 gátolta az indikátor mikroorganizmusok növekedését. Az izolált törzsek hatásspektrumát különböző Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokkal vizsgálták. Általában a S. aureus volt a legérzékenyebb indikátor mikroorganizmus, míg az Enterococcus faecalis és a Lactobacillus plantarum volt a legellenállóbb. A vizsgált tejsavbaktériumok által termelt összes antimikrobiális vegyületet proteolitikus enzimek teljesen vagy részben inaktiválták, ami fehérjés jellegükre utal. Az ebben a munkában izolált tejsavbaktériumtörzsek által termelt bakteriocinok antimikrobiális aktivitása potenciális gátként gátolhatja a romlást okozó és az élelmiszerekben előforduló patogén baktériumok növekedését.
Palavras-chave: bactérias lácticas, bacteriocinas, carne, atividade inibitória.
INTRODUCTION
A közelmúltban kísérleteket tettek arra, hogy biokonzerválási technikákat alkalmazzanak hústermékekre (18). Ezek során versenyképes tejsavbaktérium-mikroflórát vezettek be húskészítmények védőkultúrájaként, beleértve a bakteriocin-termelő tejsavbaktériumokat és tisztított anti-liszteriális bakteriocinokat (12). Tekintettel arra, hogy a bakteriocin-termelő baktériumokat olyan élelmiszerekből izolálták, amelyek általában tejsavbaktériumokat tartalmaznak, mint például a hús és a tejtermékek, már régóta fogyasztják őket. A tejsavbaktériumok által termelt bakteriocint a bakteriális riboszómaszintézis extracellulárisan termelt elsődleges vagy módosított termékeiként határozzák meg, amelyek viszonylag szűk spektrumú baktericid aktivitással rendelkezhetnek (4). A baktiocin-termelő törzsek a fermentált élelmiszerek starterkultúráinak részeként vagy kiegészítéseként használhatók a biztonság és a minőség javítása érdekében. Ebben az összefüggésben a húshoz kapcsolódó tejsavbaktériumok, mint például a Pediococcus, Leuconostoc, Carnobacterium és Lactobacillus spp. által termelt bakteriocinok valószínűleg sokkal nagyobb potenciállal rendelkeznek húskonzerváló anyagként (3,31,33,38). A bakteriocinek élelmiszer-fermentációban történő felhasználásának lehetősége ott merül fel, ahol a gátló spektrumba élelmiszerromlást okozó és/vagy patogén mikroorganizmusok is beletartoznak, ami a termelő törzsnek versenyelőnyt biztosít az élelmiszerben. A bakteriocinek fontos előnye a klasszikus antibiotikumokkal szemben, hogy az emésztőenzimek elpusztítják őket (4). Ez a tény azt jelzi, hogy e vegyületek lenyelése nem változtatja meg az emésztőrendszer ökológiáját, és nem okoz a szokásos antibiotikumok használatához kapcsolódó kockázatokat.
A bakteriocint lehetne alkalmazni a hurutos technológiában, amely a kombinált kezelések szinergiáját kihasználva hatékonyabban tartósítja az élelmiszereket (6). A nizin, a Lactococcus lactis ssp. által termelt bakteriocin használata jelenleg mintegy 50 országban engedélyezett. Mindazonáltal egyes kutatók arra a következtetésre jutottak, hogy a nizin nem hatékony a húsok alkalmazásakor a magas pH-érték (24), a baktériumiocin élelmiszerben való egyenletes eloszlásának nehézsége és a hús összetevőinek, például a foszfolipideknek (8) és a glutationnak (26) az interferenciája miatt. A nizin húsban történő felhasználásának nehézségei miatt folytatni kell az új baktériumiocin-termelő kultúrák kutatását.
A vizsgálat célja az volt, hogy egy sor húst és húskészítményt átvizsgáljunk olyan bakteriocin-termelő törzsek jelenlétére, amelyek értékesnek bizonyulhatnak a húskészítmények biokonzerválási stratégiáiban való felhasználás szempontjából. Így értékeltük az izolátumok potenciálját az élelmiszerromlás és az élelmiszerrel terjedő patogén baktériumok gátlására.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Baktériumtörzsek és táptalajok
A vizsgálatban használt törzseket az 1. táblázat tartalmazza. Az indikátorbaktériumok a következők voltak: Staphylococcus aureus CTC 33 (Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL, Campinas, Brazília), Listeria innocua Lin 11 (Pasteur Institute, Párizs, Franciaország) és Bacillus cereus CTC 1 (ITAL). Pozitív kontrollként a bakteriocin-termelő Lactobacillus casei LC 705 (Wiesby) baktériumot használták. A tejsavbaktériumok és a többi mikroorganizmus törzstenyészetét -80ºC-on tartottuk de Man Rogosa Sharpe-lében (MRS, Oxoid Ltd., Basingstoke, Egyesült Királyság) vagy 15% glicerinnel kiegészített triptikáz szójalében (TSB, Oxoid). A munkakultúrákat a tejsavbaktériumok esetében MRS-agaron, az indikátorok esetében pedig 0,6%-os élesztőkivonat (Oxoid) kiegészítéssel ellátott TSA-agaron készítettük el, és 4ºC-on tároltuk. A kísérletekhez szükséges kultúrákat hetente egyszer csíkoltuk, és egyetlen kolóniából oltottuk be a táptalajba, majd 24 órán át inkubáltuk. A tejsavbaktérium-kultúrákat felhasználás előtt kétszer átültettük a megfelelő táptalajba, és az 1. táblázatban látható feltételek szerint inkubáltuk.
Minták
Kétszáznyolcvanöt mintát elemeztünk különböző húsokból és húskészítményekből, amelyeket különböző brazil gyártóktól kaptunk. Ezek között volt friss hús, nyers, főtt, érlelt, szárított vagy erjesztett húskészítmény. A kiskereskedelmi forgalomban történő vásárlást követően minden mintát 3 ± 1ºC-on tároltak legfeljebb 24 órán keresztül az elemzés előtt.
A bakteriocin-termelő tejsavbaktériumok izolálása húsból
Minden egyes húsmintából 25 g-os adagot aszeptikusan steril stomacher zsákba helyeztünk, és 225 ml pufferelt peptonvizet (BPW, Oxoid) adtunk hozzá, hogy 1:10 arányú hígítást kapjunk. A mintákat 1 percig kevertük egy stomacher (Model 400 – BA 7021, Seward Medical, London, UK) segítségével. A minták sorozatos hígításait 0,1%-os peptonvízben készítettük. Az antagonista aktivitás kimutatására “szendvics” tesztet alkalmaztunk (37). Ehhez a hígításokat a Gram-negatív baktériumok gátlására 0,01% nátrium-aziddal kiegészített MRS agarra oltottuk (öntött lemez). A hidrogén-peroxid gátló hatását kataláz (Sigma Chemical Co., Dorset, Egyesült Királyság) hozzáadásával szüntettük meg 100 U végső koncentrációban. A szerves savtermelés okozta pH-csökkenés miatti gátlás kizárása érdekében 2%-os nátrium-b-glicerofoszfátot (Ecibra, Brazília) adtunk az MRS agarhoz. A lemezeket ugyanazzal a táptalajjal fedtük le, hogy kizárjuk a lítiás bakteriofágok okozta gátlást, amelyek nem diffundáló egységek, majd 48 órán át 35 ºC-on aerob inkubáltuk, hogy a telepek kifejlődhessenek.
Az inkubációs időszak után a legfeljebb 102 CFU-t tartalmazó lemezeket 4,5 ml lágy TSB-vel (amely 0,75% agart tartalmaz) fedtük le. Az átfedő agarra 500 ml S. aureus CTC 33 vagy L. innocua Lin 11-et vetettünk 106-107 CFU/ml mennyiségben. A lemezeket 35 ºC-on inkubáltuk 24 órán át. Az indikátor törzsek lízise tiszta zónát eredményezett. A gátlási zónát mutató kolóniákat TSB-re vittük át, és 30ºC-on inkubáltuk legfeljebb 72 órán keresztül. A tenyészeteket MRS-agar lemezeken tisztítottuk, és 30ºC-on inkubáltuk 18 órán keresztül. A tisztított izolátumokat Gram-festéssel és kataláztermeléssel vizsgáltuk, amelyet Harrigan és McCance (10) szerint határoztunk meg.
Az antagonista aktivitás kimutatása
A húsból és húskészítményekből izolált tejsavbaktériumok bakteriocin-termelését a Benkerroum és munkatársai (1) szerinti agar well-diffúziós módszerrel vizsgálták, amely a Tagg és McGiven (35) által leírt módszer módosítása. A lemezeket különböző időközönként, összesen 24 órán keresztül vizsgálták a lízis szempontjából a kutak körül. A különböző törzsek által létrehozott gátlási zónák átmérőjét közvetlenül összehasonlították.
A gátló hatás bakteriocin spektruma
A húsból és húskészítményekből izolált bakteriocin-termelő kultúrákat az 1. táblázatban szereplő baktériumtörzsekkel szemben is vizsgáltuk. A jól diffúziós vizsgálatot a korábban leírtak szerint alkalmaztuk. A széles hatásspektrumot mutató törzseket Mayr-Harting és munkatársai (19) kritikus hígítási próbájával is vizsgálták. A címet az indikátortörzs gátlását mutató legnagyobb hígítás reciprokaként határoztuk meg, amelyet megszoroztunk 100-zal, hogy az eredményeket milliliterenkénti aktivitásegységben (AU/ml) fejezzük ki.
A bakteriocinszerű anyag enzimekkel szembeni érzékenysége
A tejsavkultúrákból származó sejtmentes felülúszókat egy éjszakán át tartó MRS levestenyészetek centrifugálásával (7500 g, 10 perc, 4ºC) gyűjtöttük. A felülúszó folyadékokat 10 N NaOH-val pH 6,5-re állítottuk be, majd forró vízfürdőben hőnek (95ºC 5 percig) tettük ki. A felülúszókat a következő enzimekkel kezeltük 0,2 mg/ml végkoncentrációban: ficin (Sigma Chemical Co., Dorset, Anglia) 20 mM nátrium-foszfátban, pH 7,0; tripszin (Sigma) 40 mM Tris-HCl-ben, pH 8,2; a-hipotripszin (Sigma) 20 mM Tris-HCl-ben, pH 8,0; pronáz E (Sigma) 20 mM Tris-HCl-ben, pH 7,0.8; pepszin (Merck Darmstad, Németország)0,002 N HCl-ben; lipáz (Merck) 0,1 M kálium-foszfátban, pH 6,0; papain (Sigma) 0,05 M nátrium-foszfát-acetátban, pH 7,0. Mindezen oldatokat szűrősterilizáltuk Millex GV 0,22 m-es szűrőkön keresztül (Millipore S.A., St. Quentin-en-Yvelines, Franciaország), majd steril sejtmentes felülúszókhoz adtuk (v/v, 1/1). A kontrollok bakteriocin nélküli enzimoldatokból és csak 0,1 M nátrium-foszfát pufferben lévő sejtmentes felülúszóból álltak. A mintákat és a kontrollokat 37 ºC-on inkubáltuk 2 órán át, majd az enzimek inaktiválása érdekében 5 percig forró vízben melegítettük. A fennmaradó bakteriocin-aktivitást a Mayr-Harting és munkatársai (19) kritikus hígításos vizsgálatával határoztuk meg a korábban leírtak szerint, B. cereus CTC 1 indikátortörzset használva.
EREDMÉNYEK ÉS MEGJEGYZÉSEK
Baktériumizolálás és szűrés
Mivel a húsokból és termékekből izolált baktériumiocin-termelő baktériumok jól alkalmazkodtak ezekhez a körülményekhez, biztosíthatják ezen élelmiszerek biztonságát és meghosszabbíthatják eltarthatósági idejüket. Ezért különböző húsokból és húskészítményekből származó izolátumokban kerestük az élelmiszerromlást okozó és patogén baktériumokkal szembeni antagonista aktivitást.
Az eredmények szerint a vizsgált 285 különböző friss hús- és húskészítményminta közül 174 olyan tejsavbaktériumtörzset mutatott ki, amelyek a “szendvics” teszt alapján bakteriocinszerű anyagokat termeltek. Mindegyik mintából legalább 4, a S. aureus CTC 33 és/vagy a L. innocua Lin 11 gátlására képes kolóniát izoláltak, ami összesen 813 kolóniát jelent. De Martinis és munkatársai (7) húsz brazil hús- és húskészítménymintát vizsgáltak, és négy bakteriocin-termelő tejsavbaktériumot izoláltak, amelyek antiliszteriális aktivitást mutattak.
A tisztítást követően a kultúrákat well-diffúziós próbával ellenőrizték a bakteriocin-termelés szempontjából. Ezzel a módszerrel, a kutak különböző indikátor mikroorganizmusok tenyészeteivel történő beoltásával összehasonlítható az azonos körülmények között növő különböző törzsek bakteriocin-termelése. A 813 izolátumból csak 128 (15,7%) termelt gátlási zónákat MRS-agaron. Ezek a bakteriocin-termelő törzsek mind Gram-pozitívak és kataláz-negatívak voltak, 75,8%-uk kokkusz és 24,2%-uk pálcika volt. Schillinger és Lücke (28) hasonló eredményeket kapott a Lactobacillus sake törzsek ellenőrzésénél, amelyek pozitívak voltak az agar spot tesztben és negatívak a well-diffúziós vizsgálatban: az összesen 19 törzsből csak hat produkált gátlási zónákat agaron a well-diffúziós vizsgálatban. Lewus és munkatársai (16) azt találták, hogy a spot-on-the-lawn módszerrel pozitívnak bizonyult törzsek közül csak néhány adott pozitív eredményt a well-diffúziós vizsgálatban. Úgy vélték, hogy ha az inkubáció előtt hagynának némi időt a bakteriocineknek az agarba való diffúzióra, vagy növelnék a lyukak méretét, hogy több mintát lehessen felvinni, az növelhetné a vizsgálat érzékenységét. E szerzők szerint az aggregáció, a nem diffundálódó bakteriocinek, a proteáz inaktiváció és a koncentráció hatása mind hamis negatív eredményhez vezethet a jól diffúziós vizsgálatban.
A well-diffúziós teszt eredményei azt mutatták, hogy az izolált törzsek 64,1%-a csak a S. aureust gátolta, 11,7% pedig csak a L. innocua ellen mutatott gátló aktivitást, míg a S. aureust gátló húsizolátumok 24,2%-a a L. innocua ellen is gátolta. Lewus és munkatársai (16) szerint a kezdeti szűrés során használt indikátor mikroorganizmusnak tükröznie kell a bakteriocin-termelő törzs végső vagy javasolt alkalmazását. A S. aureus és a Listeria sp. gyakran jelen van a friss szövetekben, mivel a vágási folyamat nem tartalmaz baktériumölő lépést. A S. aureus elszaporodása az élelmiszerekben potenciális közegészségügyi veszélyt jelent, mivel a S. aureus számos törzse enterotoxint termel, amely lenyelve ételmérgezést okoz. A húst és a húskészítményeket gyakran hozzák összefüggésbe a staphylococcus okozta ételmérgezésekkel (25,36). Listeria fajokat találtak húsban és húskészítményekben (13). Az L. monocytogenes élelmiszer útján történő átvitelét a különböző élelmiszerek fogyasztásával járó emberi lisztériózis kitörésekben is kimutatták (9,17,29). A L. innocua-t gyakran izolálják húsból, és gyakran ennek a szervezetnek az előfordulása nagyobb, mint a L. monocytogenes-é (2). Javasolták a L. monocytogenes-től eltérő Listeria-fajok használatát e szervezet jelenlétének indikátoraként (39).
Az 1. ábra a hús- és húskészítményminták azon csoportjait mutatja, amelyekben a “szendvics” teszt és a well-diffúziós próba alapján bakteriocinszerű tejsavbaktériumokat mutattak ki. A “szendvics” teszttel izolált baktériumok közül azonban nem mindegyiket igazolta a well-diffúziós próba. A “szendvicsteszt” 174 (61,0%) mintában mutatott ki pozitív eredményt a bakteriocin-típusú baktériumokat termelő organizmusok tekintetében, amelyek közül csak 55 (31,1%) volt pozitív a jól diffúziós vizsgálatban. A “szendvics” teszt szerint a bakteriocin-termelő baktériumok többségét érlelt, szárított vagy fermentált húskészítményekből izolálták (78,4%). Ugyanez nem volt megfigyelhető a jól diffúziós vizsgálatban: a friss húsban volt a legtöbb bakteriocin-termelő baktérium (27,5%). Másrészt mindkét módszer azt mutatta, hogy a főtt húskészítmények kevesebb olyan mintát tartalmaztak, amelyekben a tejsavbaktériumok pozitívak voltak bakteriocinszerű anyagokra.
Ezek a negatív eredmények azt mutathatják, hogy a bakteriocin-termelés nem erősen konzervált ezekben a törzsekben. A bakteriocinok egy része plazmid-mediált fehérje (34), ezért számolni kell azzal a lehetőséggel, hogy egyes kultúrák a tisztítás során egymást követő transzferek után elveszíthették plazmidjaikat.
A gátló hatásspektrumok
A baktériumizolátumok által termelt antibakteriális vegyületek 18 indikátortörzzsel szembeni aktivitását a (2. táblázat) mutatja. Ezek a törzsek széles gátlási spektrumot mutattak, mivel a vizsgált indikátortörzsek közül sokat képesek voltak gátolni. Ezek az adatok azt sugallják, hogy több különböző indikátor mikroorganizmust kell használni a bakteriocin-szűrővizsgálatokban, hogy elkerülhető legyen egy termelő kihagyása. A vizsgált indikátortörzsek közül a S. aureus CTC 33, a Cl. sporogenes CTC 6 és a B. cereus CTC 1 volt a legérzékenyebb, amelyeket a legtöbb tenyészet gátolt, míg az Ent. faecalis ATCC 19433, a Lb. plantarum TECNOLAT 434, a szulfitreduzáló clostridium CTC 5, a Leuc. mesenteroides ATCC 10830 és a W. viridescens CCT 849 törzsek kisebb része gátolt. A bakteriocin-termelésre vizsgált törzsek közül egyik sem mutatott gátló aktivitást az összes indikátorral szemben. Csak 4 törzs (CTC 165, CTC 376, CTC 469 és CTC 484) gátolta a vizsgált indikátortörzsek többségét (az adatokat nem mutatták).
A tejsavtörzsek által okozott gátlás többsége “alacsony” gátlási zónákat eredményezett (a tisztulási zóna sugara 3 mm-nél kisebb volt). A Lb. helveticus (Wiesby) nagyon érzékeny indikátor volt, mivel az e baktérium felett vizsgált bakteriocinok által okozott gátlás 90,2%-a “magas” gátlási zónákat eredményezett (a clearance zóna sugara nagyobb volt, mint 5 mm). Az indikátor törzsekkel szemben “magas” gátlási zónákat produkáló kultúrák a következők voltak: CTC 3, CTC 12, CTC 35, CTC 36, CTC 38, CTC 40, CTC 49, CTC 51, CTC 78, CTC 141, CTC 142, CTC 144, CTC 172, CTC 176, CTC 185, CTC 204, CTC 205, CTC 206, CTC 210, CTC 211, CTC 212, CTC 231, CTC 253, CTC 330, CTC 346, CTC 352, CTC 359, CTC 375, CTC 376, CTC 377, CTC 378, CTC 396, CTC 404, CTC 469, CTC 483, CTC 484 és CTC 485 Lb ellenében. helveticus ellen; a CTC 78 és CTC 172 törzsek a B. cereus CTC 001 ellen; a CTC 172 törzs a Cl. sporogenes CTC 006 ellen; és a CTC 332 törzs a Cl. perfringens CTC 42 ellen.
Egyes törzsek bakteriocin típusú anyagokat termeltek, amelyek gátolták a vizsgált Gram-negatív baktériumokat: A Pseudomonas sp. CTC 32-t 61 (47,6%) törzs, az E. coli ATCC 25422-t 49 (38,3%) törzs és a Salm. typhimurium ATCC 14028-t 48 (37,5%) törzs gátolta. A bakteriocinek célpontja a citoplazmamembrán, így a Gram-negatív baktériumok külső membránjának LPS által biztosított védőgátja miatt a bakteriocinek általában csak Gram-pozitív sejtekkel szemben aktívak (32). A Gram-negatív baktériumok mutáns törzsei vagy protoplasztiszai azonban érzékennyé váltak a bakteriocin hatására, miután olyan szubletális stressznek tették ki őket, mint a melegítés, fagyasztás vagy felolvasztás, amelyek megbontják a külső membránt, és lehetővé teszik a bakteriocinok hozzáférését a citoplazmamembránhoz, ami fokozott érzékenységhez vezet (11,30,32).
A 128 antimikrobiális aktivitás szempontjából vizsgált tenyészet közül azt a 12-t, amely a legtöbb indikátort gátolta, Mayr-Harting és munkatársai (19) vizsgálatával vizsgálták (3. táblázat). Az eredmények szerint a B. cereus CTC 1 és a L. monocytogenes CTC 21 voltak a legérzékenyebb vizsgált mikroorganizmusok, mivel a vizsgált tejsavtörzsek 100%-ban, illetve 91,7%-ban gátolták azokat. A vizsgált indikátortörzsek között eltérés volt tapasztalható a gátlás mértékét illetően. A W. viridescens CCT 849 volt a legellenállóbb, mivel ez mutatta a legalacsonyabb aktivitási értéket. A B. cereus ATCC 14579, a Leuc. mesenteroides ATCC 10830 és a szulfit-redukáló clostridia CCT 5 közepes érzékenységet mutatott, míg a S. aureus CTC 33, a L. innocua Lin 11, a L. monocytogenes CTC 21 és a Cl. perfringens CTC 42 kevésbé rezisztens baktériumok voltak. A legérzékenyebb mikroorganizmusok, a B. cereus CTC 1, az Ent. faecalis ATCC 19433 és a Lb. helveticus (Wiesby) mutatták a legnagyobb érzékenységet néhány termelővel szemben. A termelők közül a CTC 210 és a CTC 404 törzsek mutattak alacsonyabb gátlási aktivitási értékeket, míg a CTC 469, CTC 483 és CTC 485 törzsek mutatták a legmagasabb aktivitást. A vizsgált törzsek közül a CTC 164 és a CTC 469 mutatta a legszélesebb aktivitásspektrumot, mivel az indikátorkultúrák 44,4%-át képesek voltak gátolni.
A jól diffúziós teszttel vizsgált törzsekkel szemben érzékenységet mutató mikroorganizmusok egy része, mint például a Gram-negatív fajok (E. coli ATCC 25422, Pseudomonas sp. CTC 32 és Salm. typhimurium ATCC 14028), Cl. sporogenes CTC 6, Micrococcus sp. ATCC 4698, Lb. plantarum TECNOLAT 434 és Streptococcus sp. ATCC 25175, a Mayr-Harting és munkatársai (19) által végzett vizsgálatban nem gátolták. Csak a B. cereus CTC 1 mutatta ugyanazt az érzékenységi mintázatot, amikor mindkét módszerrel elemezték.
Az indikátorkultúra gátlása nagyobb volt a well-diffúziós próbával. Mivel a termelő kultúrák és az indikátorok egyidejűleg növekedtek, a gátlást a táptalaj tápanyagaiért folytatott verseny okozhatta. A Mayr-Harting és munkatársai (19) által végzett vizsgálatban a sejtmentes felülúszók használata elkerülheti ezt a problémát.
Proteolitikus és lipolitikus enzimekkel szembeni érzékenység
A tejsavbaktériumok által termelt antibakteriális anyagok a-kimotripszin, tripszin, pronáz E, ficin, pepszin, papain és lipázzal szembeni érzékenységét kontrollált és reprodukálható körülmények között határoztuk meg (4. táblázat). Valamennyi vegyületet teljesen vagy részben inaktiválta néhány proteolitikus enzim, ami a fehérjeszerűségükre utal.
Általánosságban elmondható, hogy az e törzsek által termelt gátló vegyületek eltérő érzékenységi mintázatot mutattak. Mindegyiküket teljesen inaktiválta az a-kimotripszin, a pronáz E és a ficin. Csak egy volt ellenálló a tripszinnel szemben (CTC 141 törzs), míg a CTC 204 törzs által termelt anyag elvesztette aktivitásának 75%-át az ezzel az enzimmel való kezelés után. Egyes szerzők a nizint azáltal különböztetik meg más laktococcus baktériumiocintól, hogy az a-kimotripszin az egyetlen proteolitikus enzim, amelyre a nizin érzékeny (14,22). Ezt a tulajdonságot azonban óvatosan kell kezelni, mivel más szerzők arról számoltak be, hogy a nizin más enzimek, például a pronáz E (15,23) és a ficin (5,21) által is inaktiválható.
A pepszin a törzsek 75%-ának (CTC 141, CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 396, CTC 404, CTC 483, CTC 484 és CTC 485) antagonista aktivitását gátolta. A pepszinnel szembeni érzékenységet más bakteriocinek esetében is kimutatták: plantaricin 35d (20), sakacin A (28) és enterocin 416KI (27). A papain nem befolyásolta a CTC 141 és a CTC 404 törzsek által termelt antibakteriális anyagok aktivitását, míg a többit ez az enzim inaktiválta.
A CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 483, CTC 484 és CTC 485 törzsek által termelt vegyületek lipázzal történő kezelés után teljesen vagy részben inaktiválódtak, ami arra utal, hogy ezeknek a gátló anyagoknak kémiai összetételükben lipidrész lehet.
Érdekes megjegyezni, hogy az e törzsek által termelt vegyületeket egy sor proteolitikus enzim inaktiválta, beleértve a hasnyálmirigy eredetűeket (tripszin és a-limotripszin) és sokszor a gyomor eredetűeket (pepszin). A Gram-pozitív baktériumok bakteriocinjainak Tagg és munkatársai (34) és Klaenhammer (14) által adott definíciója alapján, valamint a tejsavbaktériumok bakteriocinjainál megfigyelt tulajdonságok (22) felhasználásával a jelen törzsek által termelt antibakteriális vegyületek a bakteriocinok közé sorolhatók. A proteázérzékenység mintázata az izolátumok által termelt bakteriocinok egyediségére és a törzsek különbözőségére utal. Bár néhány bakteriocin hasonló mintázatot mutatott a proteázérzékenység tekintetében, mint például a CTC 210 és a CTC 484 vagy a CTC 352 és a CTC 469 között, a hatásspektrumuk nem volt azonos.
Az eredmények azt mutatták, hogy a vizsgált húsminták 61%-a olyan bakteriocintermelő tejsavbaktériumokat mutatott, amelyek képesek gátolni a káros mikroorganizmusokat, például a L. monocytogenes, a S. aureus és a spórás baktériumokat. Az ebben a kutatásban izolált tejsavbaktériumok által termelt bakteriocinok antimikrobiális aktivitása gátként gátolhatja az élelmiszerek romlását és/vagy a patogén mikroorganizmusok növekedését az élelmiszerekben. További munka folyik ezen anyagok természetének és a húsok biotartósítási technikáiban való alkalmazhatóságuk értékelésére.
FELHÍVÁSOK
A szerzők köszönetet mondanak a FAPESP-nek (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) a pénzügyi támogatásért (Process 99/12314-0).
1. Benkerroum, N.; Ghouati, Y.; Sandine, W.E.; Tantaoui-Elaraki, A. Módszerek a bakteriocinok baktericid aktivitásának kimutatására. Letters Appl. Microbiol., 17: 80-81, 1993.
2. Breer, C.; Schopfer, K. Listeria és az élelmiszerek. Lancet ii: 1022, 1988.
3. Campanini, M.; Pedrazzoni, I.; Barbuti, S.; Baldini, P. A Listeria monocytogenes viselkedése a természetes és mesterségesen szennyezett szalámik érlelése során: tejsavbaktérium starterkultúrák hatása. Int. J. Food Microbiol., 20: 169-175, 1993.
4. Caplice, E.; Fitzgerald, G.F. Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. Int. J. Food Microbiol., 50(1-2): 131-149, 1999.
5. Carminati, D.; Giraffa, G.; Bossi, M. Streptococcus lactis baktériumszerű inhibitorai a Listeria monocytogenes ellen. J. Food Prot., 52(9): 614-617, 1989.
6. Cleveland, J.; Montville, T.J.; Nes, I.F.; Chikindas, M.L. Bacteriocins: safe, natural, antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol., 71: 1-20, 2001.
7. De Martinis, E.C.P.; Públio, M.R.P.; Santarosa, P.R.; Freitas, F.Z. Antilisterial activity of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packed Brazilian meat ant meat products. Braz. J. Microbiol., 32(1): 32-37, 2001.
8. De Vuyst, L.; Vandamme, E. Nisin, a Lactococcus lactis subsp. lactis által termelt lantibiotikum: tulajdonságok, bioszintézis és alkalmazások. In: De Vuyst, L.; Vandamme, E. (szerk.). Bacteriocins of lactic acid bacteria. Mikrobiológia, genetika és alkalmazások. Blackie Academic and Professional, London, 1994, p.151-221.
9. Fleming, D.W.; Cochi, S.L.; MacDonald, K.L.; Brondum, J.; Hayes, P.S.; Plikaytis, B.D.; Holmes, M.B.; Audurier, A.; Broomer, C.V.; Reingold, A.L. Pasztőrözött tej mint fertőzés hordozója egy listeriózis kitörésben. N. Engl. J. Med., 312: 404-407, 1985.
10. Harrigan, W.F.; McCance, M.E. Alapvető módszerek. In: Harrigan, W.F.; McCance, M.E. (szerk.). Laboratóriumi módszerek az élelmiszer- és tejipari mikrobiológiában. Academic Press, London, 1976, p.1-115.
11. Hauben, K.; Wuytack, E.; Soontjens, C.C.F.; Michiels, C.W. Escherichia coli nagynyomású átmeneti érzékenyítése lizozimra és nizinre a külső membrán áteresztőképességének megszakításával. J. Food Prot., 59: 350-355, 1996.
12. Hugas, M.; Monfort, J.M. Bakteriális starterkultúrák húsfermentációhoz. Food Chem., 59(4): 547-554, 1997.
13. Johnson, J.L.; Doyle, M.P.; Cassens, R.G. Listeria monocytogenes és más Listeria spp. húsban és húskészítményekben. Egy áttekintés. J. Food Prot., 53(1): 81-91, 1990.
14. Klaenhammer, T.R. A tejsavbaktériumok bakteriocinjai. Biochimie, 70: 337-349, 1988.
15. Kojic, M.; Svircevic, J.; Banina, A.; Topisirovic, L. A Lactococcus lactis subsp. diacitilactis S50 bakteriocin-termelő törzse. Appl. Environ. Microbiol., 57(6): 1835-1837, 1991.
16. Lewus, C.B.; Kaiser, A.; Montville, T.J. Élelmiszerből származó kórokozók gátlása húsból izolált tejsavbaktériumokból származó bakteriocinekkel. Appl. Environ. Microbiol., 57(6): 1683-1688, 1991.
17. Linnan, M.J.; Mascola, L.; Lou, X.D.; Goulet, V.; May, S.; Salminen, C.; Hird, D.W.; Yonekura, M.L.; Hayes, P.; Weaver, R.; Audurier, A.; Plikaytis, B.D.; Fannin, S.L.; Kleks, A.; Broome, C.V. Mexikói típusú sajttal kapcsolatos járványos lisztériózis. N. Engl. J. Med., 319: 823-828, 1988.
18. Lücke, F-K. Mikrobák hasznosítása hús feldolgozására és tartósítására. Meat Sci., 56: 105-115, 2000.
19. Mayr-Harting, A.; Hedges, A.J.; Berkeley, C.W. Módszerek a bakteriocinek vizsgálatára. In: Norris, J.R.; Ribbons, D.W. (szerk.). Methods in Microbiology. Academic Press Inc., New York, 1972, p.316-422.
20. Messi, P.; Bondi, M.; Sabia, C.; Battini, R.; Manicardi, G. Egy Lactobacillus plantarum törzs által termelt bakteriocin (plantaricin 35d) kimutatása és előzetes jellemzése. Int. J. Food Microbiol., 64: 193-198, 2001.
21. Moreno, I.; Lerayer, A.L.S.; Baldini, V.L.S.; Leitão, M.F.F. Lactococcus lactis törzsek által termelt bakteriocinok jellemzése. Braz. J. Microbiol., 31(3): 184-192, 2000.
22. Piard, J.C.; Desmazeaud, M. Tejsavbaktériumok által termelt gátló faktorok. 2. Bakteriocinek és más antibakteriális anyagok. Lait, 72: 113-142, 1992.
23. Rammelsberg, M.; Radler, F. Lactobacillus fajok antibakteriális polipeptidjei. J. Appl. Bacteriol., 69: 177-184, 1990.
24. Rayman, K.; Malik, N.; Hurst, A. A nizin nem gátolja a Clostridium botulinum elszaporodását egy pácolt hús modellrendszerben. Appl. Environ. Microbiol., 46: 1450-1452, 1983.
25. Roberts, D. Közegészségügyi jelentőségű baktériumok. In: Brown, M.H. (szerk.) Meat microbiology. Applied Science Publishers Ltd., London, 1982, p.319-386.
26. Rose, N.L.; Sporns, P.; Stiles, M.E.; McMullen, L.M. A nizin inaktiválása glutation által friss húsban. J. Food Sci., 64(5): 759-762, 1999.
27. Sabia, C.; Manicardi, G.; Messi, P.; Niederhäusern, S.; Bondi, M. Enterocin 416K1, egy olasz kolbászokból izolált Enterococcus casseliflavus IM 416K1 által termelt antilisterialis bakteriocin. Int. J. Food Microbiol., 75: 163-170, 2002.
28. Schillinger, U.; Lücke, F-K. Húsból izolált Lactobacillus sake antibakteriális aktivitása. Appl. Environ. Microbiol., 55(8): 1901-1906, 1989.
29. Schlech, W.F.; Lavigne, P.M.; Bortolussi, R.A.; Allen, A.C.; Haldane, E.V.; Wort, A.J.; Hightower, A.W.; Johnson, S.E.; King, S.H.; Nicholls, E.S.; Broome, C.V. Epidemiás listeriózis – bizonyíték az élelmiszer általi átvitelre. N. Eng. J. Med., 308: 203-204, 1983.
30. Schved, F.; Henis, Y.; Juven, B.J. Gram-negatív baktériumok szferoplasztjainak és kelátor-permeabilizált sejtjeinek válasza a pediocin SJ-1 és nizin bakteriocin hatására. Int. J. Food Microbiol., 21: 305-314, 1994.
31. Shahidi, F. Alternatív húspácoló rendszerek fejlesztése. Trends Food Sci. Technol., 2: 219-222, 1991.
32. Stevens, K.A.; Sheldon, B.W.; Klapes, N.A.; Klaenhammer, T.R. Nizin kezelés a Salmonella fajok és más Gram-negatív baktériumok inaktiválására. Appl. Environ. Microbiol., 57: 3613-3615, 1991.
33. Stiles, M.E.; Hastings, J.W. Bakteriocin termelés tejsavbaktériumok által: A húskonzerválásban való felhasználás lehetőségei. Trends Food Sci. Technol., 2: 247-251, 1991.
34. Tagg, J.R.; Dajani, A.S.; Wannamaker, L.W. Gram-pozitív baktériumok bakteriocinjai. Bacteriol. Rev., 40: 722-756, 1976.
35. Tagg, J.R.; McGiven, A.R. Assay system for bacteriocins. Appl. Microbiol., 21(5): 943, 1971.
36. Varnam, A.H.; Sutherland, J. Főtt pácolt húsok. In: Varnam, A.H.; Sutherland, J.P. (szerk.). Hús és húskészítmények. Technológia, kémia és mikrobiológia. Chapman & Hall, London, 1995, p.298-313.
37. Yang, R.; Ray, B. A vákuumcsomagolt feldolgozott húsok romlásával összefüggésbe hozható pszichrotróf leukonosztokok prevalenciája és biológiai kontrollja. J. Food Prot., 57(3): 209-217, 1994.
38. Yousef, A.E.; Luchansky, J.B.; Degnan, A.K.; Doyle, M.P. A Listeria monocytogenes viselkedése bécsi exsudátumokban Pediococcus acidilactici H vagy pediocin AcH jelenlétében 4 vagy 25ºC-on történő tárolás során. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1461-1467, 1991.
39. Az Egészségügyi Világszervezet informális munkacsoportja az élelmiszer eredetű liszteriózissal kapcsolatban. Élelmiszer eredetű liszteriózis. WHO/WHE/FOS/88.5 számú dokumentum. Egészségügyi Világszervezet: Genf, Svájc, 1988.