Vizsgálatunkban, retrospektív módon kimutattuk a CALR-mutációk jelenlétét egy 524 JAK2 V617F-negatív betegből álló kohorszban, akik MPN klinikai és/vagy laboratóriumi gyanújával jelentkeztek, azzal a fő céllal, hogy meghatározzuk e kimutatás diagnosztikai értékét. A megfigyelt időszakban a CALR-mutációkat központunkban nem vizsgálták rutinszerűen MPN-gyanús betegeknél, mivel csak nemrégiben fedezték fel őket1,2. Ezzel szemben a JAK2 V617F mutációt 2005-ös felfedezése20 óta már rutinszerűen elemzik. Ezért a JAK2 V617F-pozitív betegeket kizártuk a vizsgálatból. Az MPL-mutáció viszonylag ritka lelet MPN-betegeknél, és többnyire ET- vagy PMF-betegeknél fordul elő21. Laboratóriumunkban az MPL-vizsgálat csak nemrégiben került be a diagnosztikai algoritmusba MPN-gyanús betegeknél, és csak a JAK2 V617F és a CALR-mutáció kizárása után végzik el. Ezért az MPL-státuszt nem határoztuk meg minden betegünknél az első vizsgálat idején.
A központunk egy egyetemi orvosi kórház, amely egy körülbelül 1.000.000 lakosú területet szolgál ki, és a hematológiai malignitások beutalóközpontja. A hematológiai osztályra beutalt valamennyi beteget először háziorvosok értékelték ki, akik nem rendelkeztek részletes ismeretekkel a hematológiai rosszindulatú daganatok területén. Amint azt a 3. táblázat mutatja, a hematológiai osztályra utalt betegeknek csak egy része rendelkezett az első vizsgálat idején MPN-re gyanús patológiai klinikai és/vagy laboratóriumi paraméterekkel. Ezért a hematológiai osztályra beutalt betegek többsége hematológiai malignitással nem rendelkező egyén volt, mivel megállapítottuk, hogy 380 beteg (380/524 = 72,5%) MPN-mentes volt. Ezeknél a betegeknél a perifériás vértartalom másodlagos változásait diagnosztizálták, amelyeket különböző állapotok, például vashiány, fertőző és gyulladásos betegségek, hyposplenizmus, rosszindulatú daganat, dohányzás, friss műtét, kortikoszteroidok használata és krónikus hypoxia okozott. Ennek megfelelően a CALR-pozitív betegek száma kohorszunkban alacsony volt. Az MPN-gyanús betegek 4,4%-át azonosítottuk CALR-pozitívnak, akiknek többségénél vagy ET-t vagy PMF-et diagnosztizáltak. A legtöbb hasonló tanulmány a CALR-pozitív betegek számát elemezte igazolt MPN esetén; ezért a CALR-pozitív betegek száma sokkal magasabb volt, 12-től több mint 20%-ig terjedt22,23,24,25,26 . Adataink alapján hasznos lenne javítani a diagnosztikai megközelítést azon betegek esetében, akiknél egy vagy több vérsejtvonal megnövekedett szintje figyelhető meg, mivel a legtöbb esetben ezt nem hematológiai malignitás okozza. A betegeket rutinszerűen szűrni kellene a másodlagos erythrocytosis, thrombocytosis és leucocytosis leggyakoribb okaira, és a vérképet legalább egyszer meg kellene ismételni a kontrollvizsgálatok alkalmával, mielőtt a hematológiai osztályra irányítják őket. A molekuláris genetikai vizsgálatot a klonális hematológiai betegség nagyfokú gyanúja esetén kell fenntartani, és nem szabad minden, a hematológiai osztályra beutalt betegnél elvégezni.
A JAK2 V617F-negatív, ET1,2-ben szenvedő betegeknél gyakran azonosítanak CALR-mutációkat. Központunkban a CALR-pozitív betegeknek csak egy kisebbségét (7/23 = 30%) diagnosztizálták ET-vel a 2008-as WHO-kritériumok szerint az első vizsgálat idején. Ennek fő oka a csontvelővizsgálattal szembeni viszonylagos fenntartás volt a mérsékelt trombocitózissal és a trombotikus szövődmények alacsony kockázatával rendelkező betegek esetében. Ez azonban azt jelenti, hogy alábecsülhettük a klonális trombocitózisban szenvedő betegek számát. A CALR-mutációk jelenlétének megerősítésével 9 beteget tudtunk retrospektív módon ET-vel diagnosztizálni az ET módosított WHO-kritériumai13 szerint. Bár a klonális trombocitózis nagyfokú gyanúja miatt valamennyi beteg nyomon követése osztályunkon történt, nagy prognosztikai és terápiás előnyt jelent, ha az ET diagnózisát egy olyan nem invazív eljárással, mint a molekuláris-genetikai vizsgálat, meg tudjuk erősíteni. A CALR-mutációk ezért az ET fontos diagnosztikus ismertetőjegyei, amint azt a közelmúltban az irodalom is megerősítette27,28.
A PMF-ben szenvedő betegek mindegyikét a WHO-kritériumok szerint diagnosztizálták a hematológiai osztályon végzett vizsgálat idején. A CALR-mutáció azonosítása retrospektív módon megerősítette a diagnózist, de közvetlen diagnosztikai vagy terápiás hatása nem volt.
A CMML az MDS/MPN-ek egyik altípusa, és nem szigorúan MPN12. A CMML-ben szenvedő betegeknél a CALR-mutációk rendkívül ritkák, és nem játszanak fontos szerepet a patogenezisben. A Zamora és munkatársai által végzett csoportos vizsgálat kimutatta, hogy 174 CMML-es beteg közül mindössze 1 betegnél fordult elő CALR-mutáció29. A mi vizsgálatunkban szereplő beteget, akinél első típusú CMML-t diagnosztizáltak, majd később myelofibrózissá progresszálódott, az első vizsgálat idején tévesen diagnosztizálhatták, mivel a PMF és a CMML számos közös jellemzővel rendelkezik, beleértve a monocitózist és a csontvelőfibrózist. Hu és munkatársai nemrégiben végzett vizsgálatában egy pontosabb elemzés lehetővé tette, hogy számos CMML-nek diagnosztizált beteget átminősítsenek PMF-nek, ami azt mutatja, hogy a pontos diagnózis felállításához alaposabb elemzést kell végezni, különösen az ET/PMF-re jellemző molekuláris biomarkerekkel rendelkező betegek esetében11,30.
Már több mint 50 frameshift CALR-mutációt írtak le, és mindegyik a CALR-gén 9-es exonjában található. A CALR-mutációknak két fő típusa van: az 1-es típus (52-bp deléció; p.L367fs*46) és a 2-es típus (5-bp TTGTC inszerció; p.K385fs*47). Molekuláris jellemzőik alapján az egyéb mutációkat 1-es és 2-es típusba lehet sorolni31. Vizsgálatunkban a CALR-mutáció leggyakoribb típusa az 1-es típus volt, ami összhangban van az irodalmi adatokkal2,16,32. Azokat a mutációkat, amelyek nem 1-es vagy 2-es típusúak, 1-es vagy 2-es típusúaknak kell alosztályozni, mivel ez hatással lehet a klinikai fenotípusra, és a PMF esetében még a túlélésre is17. Vizsgálatunkban az 1-es és 2-es típusú mutációkat az AGADIR15 segítségével határoztuk meg, amely egy statisztikai közelítő algoritmus, amely a CALR-mutációk által megváltoztatott 31 egyedi aminosav-szekvenciára kiszámítja a helix hajlamot16. Ezt az algoritmust hasonló vizsgálatokban már használták, és fontos eszközt jelent a CALR-mutációk alosztályozásában16,17. Rendkívül fontosnak tűnik a CALR-mutáció típusának megfelelő meghatározása, mivel ennek diagnosztikai hatása is van. Ismeretes, hogy csak az olvasási keret + 1 (-1 + 2) frameshiftjéhez vezető mutációk patogének6. Más CALR-mutációk lehetnek a CALR csíravonalbeli változatai, amelyek klinikai jelentősége ismeretlen. Vizsgálatunkban két betegnél mutattak ki nem frame shift CALR-mutációkat. Az egyik betegnél a hematológiai osztályon végzett vizsgálat idején reaktív trombocitózist diagnosztizáltak, és visszamenőleg CALR-pozitívként határozták meg. A részletes elemzés megerősítette a CALR missense mutációját, amely a 398-as aminosavpozícióban glutaminsav aszparaginsavval való helyettesítését eredményezi. Ugyanezt a mutációt fedezték fel egy WHO által meghatározott krónikus neutrofil leukémiában (CNL) szenvedő betegnél Lasho és munkatársai tanulmányában. Tanulmányában arra a következtetésre jutott, hogy azok a CALR-mutációk, amelyek nem eredményeznek különálló C-terminus kialakulását, más, esetleg még ismeretlen patogenetikai mechanizmusra utalnak33. Tanulmányunkban feltételeztük, hogy betegünknél nem alakult ki olyan CALR-mutáció, amely klonális hematológiai betegséget feltételezne. A beteg anamnézise, klinikai vizsgálata és laboratóriumi leletei alapján leginkább reaktív trombocitózisra utalt. A cikk megírásának időpontjában a beteg jó egészségi állapotban volt, a klonális hematológiai betegséggel járó esetleges szövődmények nélkül.
Egy másik, nem frame shift CALR-mutációval rendelkező betegnél MPN-U-t diagnosztizáltak. Ez a beteg csíravonalbeli in-frame deléciót hordozott a CALR génben (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), amelyet már korábban felismertek egy tüneteket mutató MPN34-es betegnél. Bár a KDEL-motívum megmaradt, egy aminosav deléciója (p.(Glu381del)) a fehérje másodlagos szerkezetének, valamint háromdimenziós szerkezetének megváltozásához vezetett, ami ennek az in-frame deléciónak a patogén jellegére engedett következtetni23,34,35 . A mi MPN-U-s betegünk sajnos elveszett a követés során, és a pontos hematológiai diagnózist vagy az esetleges szövődményeket nem lehetett meghatározni. A laboratóriumi leletek azonban klonális hematológiai betegségre utaltak.
Vizsgálatunkban négy új CALR-mutációt fedeztünk fel a 9-es exonban, amelyeket tudomásunk szerint még nem regisztráltak a COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) vagy a HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk) adatbázisban. A COSMIC adatbázis a világ legnagyobb, szakértők által kurált adatbázisa a humán rákban előforduló szomatikus mutációkról. Több mint 4 millió kódoló mutációt ír le36. A HGMD adatbázis kísérletet tesz az emberi örökletes betegségekért felelős összes ismert (publikált) génelváltozás összegyűjtésére19. A vizsgálatunkban meghatározott új mutációk a következők: NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), és NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Mindezek a mutációk 2-es típusú mutációk voltak.
Az ET és a PMF a trombotikus és tromboembóliás események fokozott kockázatával jár, amelyek a morbiditás és a mortalitás fontos okai37. A trombotikus és tromboembóliás szövődmények kockázatának csökkentése a kezelés egyik legfontosabb célja, különösen az ET-ben szenvedő betegek esetében38. Ezeknél a betegeknél a vérzéses szövődmények kockázata is nagyobb, ami a kezelés szövődményeivel vagy az extrém trombocitózis (vérlemezkék > 1000 × 109/L)28,39,40 miatti szerzett von Willebrand-szindrómával (AVWS) függhet össze. Az ET-ben szenvedő betegeknél a trombózis kockázata meghaladja a 20%-ot41. Egy svéd vizsgálatban az ET-ben szenvedő betegek 35%-ánál alakultak ki vaszkuláris szövődmények42. PMF-ben a trombotikus események körülbelül ugyanolyan gyakoriak, mint ET-ben43. A trombotikus szövődmények prevalenciája PMF-ben szenvedő betegeknél 7-30% között mozog44,45,46. Vizsgálatunkban a CALR-pozitív betegeknél a trombotikus szövődmények prevalenciája 30% volt. Három betegnél azonban több mint 10 évvel azelőtt alakult ki trombotikus szövődmény, hogy felmerült volna a MPN diagnózisának gyanúja. A trombotikus szövődmények valódi prevalenciája vizsgálatunkban tehát alacsonyabb volt. Egy betegnél üvegtestvérzés alakult ki, ami a nem megfelelő antikoagulációs kezelés (warfarin) következménye volt. A két vérzéses szövődményben szenvedő beteg közül egyiknek sem volt extrém trombocitózisa a szövődmény idején. A JAK2 V617F és az MPL mutációkkal összehasonlítva a CALR kedvező mutáció, és a trombotikus események alacsonyabb előfordulási gyakoriságával jár együtt1,2,47 . A legtöbb CALR-pozitív betegnél, akiknél trombo-haemorrhagiás szövődmény alakult ki, 1-es típusú mutációt diagnosztizáltak (71,4%). Amint azt már kimutattuk, az 1-es típusú mutációval rendelkező betegeknél magasabb volt a trombózis kockázata a 2-es típusú mutációval rendelkező betegekhez képest10.
A CALR-mutációk jelenleg a JAK2 V617F és az MPL-mutáció mellett a három fő mutációtípus egyikeként ismertek az ET-ben vagy PMF-ben szenvedő betegeknél. Ugyanakkor az ET-ben vagy PMF-ben szenvedő betegek 10-15%-ában még mindig volt olyan beteg, akinek a betegség hátterében ismeretlen molekuláris genetikai marker állt. Ezeket a betegeket “hármas negatívnak “48 nevezik. Ezekben a betegekben új molekuláris biomarkereket kerestek a myeloid rákgének kódoló exonjainak szekvenálásával, ami ígéretes eredményeket mutatott. Ez személyre szabott megközelítést nyújthat az MPN-ben szenvedő betegek diagnózisához49.
CALR mutációkat MPN-es betegeknél szintén vizsgálják terápiás potenciáljukat50,51,52. A CALR exon 9 mutációi a rák immunterápiájának célpontjai lehetnek, mivel immunogén neoantigénekként viselkednek51. Az MPN kezelésében előnyös lehet a CALR-vakcinákat immunmoduláns kezelésekkel53 , például interferon-alfa (IFN-α)54 vagy programozott halál 1 ligandummal (PD-L1)55 kombinált rák elleni vakcinációként kombinálni. A CALR-mutációk amellett, hogy fontos diagnosztikai és prognosztikai markerek az MPN-es betegeknél, a jövőben fontos terápiás célpontokká válhatnak az MPN-es betegek egy alcsoportjában.