CD11c+ monocita/macrofágok elősegítik a krónikus Helicobacter hepaticus-indukált bélgyulladást az IL-23 termelésén keresztül

H. hepaticus által kiváltott gyulladás megváltoztatja a bél mononukleáris fagociták kompartmentjét

A Helicobacter hepaticus (Hh) Gram-negatív baktérium egy nem invazív organizmus, amely gyakran megtalálható az egér alsó bélcsatornájának nyálkahártya rétegében. A baktériummal fertőzött vad típusú állatokban nem alakul ki bélrendszeri immunpatológia, és a fertőzés hordozóiként szolgálnak.21 Az IL-10/IL-10R útvonal genetikai hiányosságait mutató egerek azonban fogékonyak a kísérleti Hh-fertőzésre, és a vastagbél és a vakbél súlyos gyulladása (typhlocolitis) alakul ki bennük, amely epithelialis hyperplasiával jár együtt22, 23 Hasonlóképpen, a vad típusú egerek Hh-fertőzése és az anti-IL-10R monoklonális antitestek (mAbs) egyidejű adása IL-23-függő bélgyulladást vált ki, erőteljes T helper 1/típusú 17 (Th1/Th17)-polarizált effektor T-sejtválasz mellett.23 A Hh-val fertőzött és anti-IL-10R antitestekkel kezelt egereknél – a nem fertőzött vagy egyszeresen kezelt kontrolloknál nem – a fertőzést követő 2-3 héten belül a vastagbélgyulladás szövettani jellemzői alakulnak ki (1a. ábra). A Hh-val és anti-IL-10R-ellenes antitestekkel kezelt egerek továbbá a leukociták kifejezett infiltrációját mutatják a lamina propria belsejében (1b. ábra), beleértve a neutrofilek és az MHCII+ monociták domináns populációit (1c. ábra és az S1a online kiegészítő ábra). A nem gyulladt vastagbélben a vérből a lamina propriába jutó monocitákból elsősorban szöveti makrofágok11 (CD11b+ CX3CR1hi Ly6Clo sejtekként definiálva, zöld alcsoport) keletkeznek, amelyek magas CD64, MHCII, F4/80 és CD11c szintet expresszálnak (1d. ábra és S1b kiegészítő ábra). Ez a folyamat azonban gyulladás során drámaian megváltozik, és megfigyeltük az MHCII+ monociták (CD11b+ CX3CR1int Ly6Chi sejtekként definiálva, piros alcsoport) kifejezett felhalmozódását a vastagbél lamina propria területén. Ezeket a sejteket a CD64 és az MHCII expressziója, valamint az F4/80, a CD24 és a CD11c köztes szintje jellemzi (1c-e ábra és S1a kiegészítő ábra). Stabil állapotban az MHCII+ monociták és makrofágok expresszálják a mannózreceptort (CD206), amely a makrofágok gyulladásgátló funkciójával kapcsolatos marker.24 A CD206 expressziója azonban alacsonyabb volt az MHCII+ monocitákban és makrofágokban a vastagbélgyulladás során (1f. ábra), ami arra utal, hogy nemcsak a monociták, hanem a makrofágok funkciói is módosulnak a gyulladás során. Valóban azt találtuk, hogy a gyulladás során az MHCII+ monociták nagyobb mennyiségű tumor nekrózis faktor-α és IL-6 fehérjét, valamint Nos2 (indukálható nitrogén-oxid-szintáz) mRNS-t fejeztek ki, és az IL-6 a makrofágokban is megnövekedett (S1c kiegészítő ábra). Az IL-10 termelése mind az MHCII+ monociták, mind a makrofágok esetében szintén megnövekedett a gyulladás során (Kiegészítő S1c ábra), ami valószínűleg a gyulladás által vezérelt negatív visszacsatolási útvonalat tükrözi.

Az MHCII+ monocitákról kimutatták, hogy makrofágokká történő differenciálódásuk mellett egy Ly6Clo CX3CR1int heterogén, a makrofágokkal és a klasszikus DC-kkel egyaránt rokonságban álló alcsoporttá is differenciálódnak.11 E heterogén kompartmenten belül a CD11b+ DC-k (CD11c+ CD103- CD11b+ CD11b+ CX3CR1int sejtekként definiálva, szürke alcsoport) homeosztatikus körülmények között könnyen megkülönböztethetők a makrofágoktól. A CD11b+ DC-k expresszálják az MHCII-t, a CD24-et és a CD11c-t, de hiányzik belőlük a makrofágokhoz általában társított CD64 és F4/80 markerek expressziója (1d. ábra és S1b kiegészítő ábra). A makrofágok és a CD11b+ DC-k közötti különbségtétel azonban a gyulladás során elmosódott a CD64-et expresszáló populáció megjelenésével (1d,e ábra), és jelenleg nem világos, hogy ezek a sejtek ontogenetikai és funkcionális szempontból hogyan viszonyulnak a stabil állapotú makrofágokhoz vagy a CD11b+ DC-khez.

A colitis során az MHCII+ monociták kifejezett felhalmozódása korrelált a makrofágok, CD11b+ DC-k és CD103+ DC-k (a CD11c+ CD103+ CX3CR1- sejtek, narancssárga alcsoportként definiálva) csökkent gyakoriságával a CD45+ lamina propria sejtek között (1c,d ábra). Az abszolút számok azonban a CD11b+ DC-k és a CD103+ CD11b+ DC-k kis mértékű növekedését jelezték. Ezzel szemben a makrofágok száma változatlan maradt, a CD103+ CD11b- DC-k száma pedig enyhén csökkent (S1a. kiegészítő ábra).

Összességében a Hh-fertőzés IL-10R-blokád jelenlétében bélgyulladást vált ki, amely a myeloid kompartment drámai változásaival jár együtt. Megfigyeltük a granulociták és az MHCII+ monociták domináns felhalmozódását a vastagbél lamina propria területén. Emellett az MHCII+ monociták és makrofágok proinflammatorikusabb profilra tettek szert.

CD11c+ mononukleáris fagociták az IL-23 termelésén keresztül hajtják a vastagbélgyulladást

Mivel az IL-23-at a vastagbélgyulladás fő hajtóerejeként azonosították ebben a modellben,23 a következőkben a mononukleáris fagociták IL-23 termelésének funkcionális jelentőségét vizsgáltuk a Hh+ anti-IL-10R modellben a vastagbélgyulladás kialakulásában. Ezért a zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) és Cre rekombinázt a CD11c promóter (amelyet az Itgax kódol)25, 26 és az Il23a gén négy exonját27 flankáló két loxP-helyet tartalmazó egerekkel kereszteztük, hogy Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-) egereket hozzunk létre.

Mivel a CD11cIL-23- egerek a CD11c promóter kontrollja alatt expresszálják a GFP-t, és ezért nem keresztezhetők CX3CR1-GFP riporter egerekkel, alternatív kapuzási stratégiára támaszkodtunk a myeloid kompartment értékeléséhez ezekben az egerekben (S2. kiegészítő ábra). Állandósult állapotban a CD11cIL-23- egereknek hasonló számú leukocita volt a vastagbélben, mint IL-23-professzív alaktársaiknak (CD11cIL-23+) (S3a. kiegészítő ábra), és a myeloid vagy T-sejtek gyakoriságában nem észleltünk jelentős változásokat (S3b. kiegészítő ábra). Mivel azonban az IL-23 szükséges a differenciált Th17 sejtek fenntartásához,28 a CD11cIL-23- egereknél erősen csökkent az IL-17+ és az IL-17+ IFNγ+ CD4+ T-sejtek száma a vastagbélben (S3c kiegészítő ábra).

Hh fertőzés és anti-IL-10R kezelés hatására a CD11cIL-23- egerek a CD11cIL-23+ egerekhez képest feltűnően csökkent vastagbélgyulladást mutattak, csökkent epiteliális kriptahyperpláziával és alacsonyabb leukocita-infiltrációval az egész vastagbélben és a cecumban (2a,b ábra). A CD11cIL-23- egereknél nem alakult ki splenomegália (2c. ábra), ami azt jelzi, hogy a betegség szisztémás tüneteitől is védettek voltak. A CD11cIL-23- egerekben megfigyelt csökkent patológia nem a differenciált bakteriális terhelés következménye volt, mivel a Hh-kolonizáció szintje hasonló volt a CD11cIL-23- és a CD11cIL-23+ csoportokban (2d. ábra). A csökkent patológiai változásokkal összhangban a CD11cIL-23- egerek vastagbelében a Hh- és IL-10R-blokádot követően mind a veleszületett, mind az adaptív effektorcitokinek mennyisége erősen csökkent (2e. ábra), csakúgy, mint maga az IL-23 mennyisége (2f. ábra).

A csökkent leukocita-infiltrációval összhangban a CD11cIL-23- egerek a Hh-fertőzést és az IL-10R-blokádot követően a hasonlóan kezelt CD11cIL-23+ alaktársakhoz képest csökkent MHCII- és MHCII+ monociták (3a. ábra) és neutrofilek (S3d kiegészítő ábra) gyakoriságát és számát mutatták a lamina propria területén. A monociták alacsonyabb infiltrációja a CD11cIL-23- egerekben korrelált a lamina propria makrofágok magasabb gyakoriságával, míg a CD11b+ DC-k és a CD103+ DC-k gyakorisága nem változott, abszolút számuk pedig csökkent (S3d. kiegészítő ábra).

Mivel az IL-23 a T-sejtekre gyakorolt közvetlen hatásán keresztül hajtja a bélgyulladást, elősegítve azok felhalmozódását és proliferációját a vastagbélben,29 megvizsgáltuk a CD11cIL-23- és CD11cIL-23+ egerek vastagbél T-sejt kompartmentjét vastagbélgyulladás során. A CD11cIL-23- egereknél alacsonyabb volt a vastagbél CD4+ T-sejtek gyakorisága az IL-23-professzív alaktársaikhoz képest (3b. ábra). Míg a CD11cIL-23+ egerek robusztus Th1/Th17 effektorválaszt hoztak létre, amelyet az egy- és kétszeresen termelő IL-17A+/IFNγ+ T-sejtek megjelenése jellemzett, a CD11cIL-23- egerek a megfelelő citokinek csak enyhe indukcióját mutatták (3c. ábra).

A CD11cIL-23- egereknél a vastagbélgyulladás hiánya azt jelzi, hogy a CD11c-expresszáló MNP-k által termelt IL-23 nem redundáns szerepet játszik a bél gyulladásos válaszában.

MHCII+ monociták és makrofágok az IL-23 fő forrása H. hepaticus fertőzéskor

Az IL-23-hiányos egerekben a vastagbél lamina propria-jából tisztított leukocitákban először az IL-23 expresszióját követtük nyomon. Az Il23a mRNS expressziója következetesen kimutatható volt 4-5 nappal a vastagbélgyulladás kezdetét követően (4a. ábra), ami arra utal, hogy egy szövetrezidens és/vagy gyorsan mobilizálódó sejtes alcsoport vesz részt az IL-23 korai termelésében a vastagbélben. Ezért ezt az időpontot választottuk a későbbi elemzésekhez. A Hh-fertőzést és az anti-IL-10R kezelést követő 4. napon a CD11cIL-23+ egerek fokozott leukocita-infiltrációt mutattak a lamina propria-ban a nem fertőzött kontroll egerekhez képest (4b. ábra). Ez a beáramlás korrelált az összes MNP-alcsoport megnövekedett számával a vastagbélben (S4a,b kiegészítő ábra), valamint az MHCII- és MHCII+ monociták (4c,d ábra), neutrofilek (4d ábra), CD103+ CD11b- DC-k és CD103+ CD11b+ DC-k (4e ábra) megnövekedett gyakoriságával. A makrofágok és a CD11b+ DC-k gyakorisága az összes leukocitán belül azonban nem változott ebben az időpontban (4d. ábra).

Az IL-23-függő bélgyulladásban részt vevő myeloid alcsoportok további jellemzése érdekében megvizsgáltuk a CD11c-Cre-asszociált GFP expressziót a CD11cIL-23+ egerek lamina propria sejtjei által. A CD45+ sejtek elemzése megerősítette, hogy a Cre-GFP-expresszió a sejtfelszínükön CD11c-t expresszáló leukocitákra korlátozódott (4f. ábra), de túlnyomórészt a CD11chi sejtekben volt megfigyelhető. Továbbá, a Cre-asszociált GFP fluoreszcencia csak az MHCII+ sejtekben volt megfigyelhető (4g. ábra), és érdekes módon az Il23a mRNS expressziója a Cre-GFP+ sejtekre korlátozódott (4h. ábra). A lamina propria MNP-k többsége magas CD11c-szintet expresszál (1e. ábra és S1b kiegészítő ábra). A CD11cIL-23+ egerekben a különböző myeloid alcsoportok elemzése azt mutatta, hogy a CD11c-Cre-asszociált GFP-expresszió túlnyomórészt makrofágok, CD103+ CD11b- DC-k, CD103+ CD11b+ DC-k, (4i. ábra) és CD11b+ DC-k között volt kimutatható (nem látható). Ezenkívül az MHCII+ monociták több mint fele pozitív volt Cre-GFP-re, ami arra utal, hogy ezek az alcsoportok mindegyike az IL-23 potenciális forrása lehet. Ezzel szemben a Cre-expresszió hiányzott az eozinofilekből, neutrofilekből és MHCII- monocitákból (4i. ábra).

Az IL-23 in vivo funkcionális forrását jelentő alcsoportok közül melyiket jellemezzük, 4 nappal a Hh-fertőzést követően, IL-10R-blokád jelenlétében, a CD11cIL-23- és CD11cIL-23+ egerekből áramlási citometriával kiválogatott megfelelő populációk Il23a mRNS-expresszióját vizsgáltuk. Feltűnő, hogy az Il23a mRNS-expresszió a CD11cIL-23+ sejtekben főként az MHCII+ monocitákra és makrofágokra korlátozódott, alacsony expresszió volt kimutatható a CD103+ CD11b- DC-k és a CD103+ CD11b+ DC-k között (4j. ábra). Továbbá az Il23a expressziója mind az MHCII+ monociták, mind a makrofágok által jelentősen csökkent a CD11cIL-23- egerekben, ami azt jelzi, hogy a CD11c-Cre-expresszió aktív volt ezekben a sejtalcsoportokban (4j. ábra). Az MHCII- monocitákban megfigyelt alacsony Il23a expresszió (4k. ábra) arra utal, hogy az IL-23 indukciója a lamina propria-ban történik helyi érésük és az MHCII megszerzése során.

Mivel a CX3CR1 expresszió szintje az MNP-k diszkrét alcsoportjait azonosítja, megismételtük elemzésünket CX3CR1GFP/+ egerekben. A nem fertőzött egerekben az MHCII+ monociták, a CD103+ CD11b+ DC-k (S4c,d kiegészítő ábra) és a CD11b+ DC-k (S4d kiegészítő ábra) között alacsony konstitutív Il23a szintet mutattunk ki. Az Il23a fokozott expressziója a Hh és IL-10R blokkolással történő fertőzést követő 4 napon azonban következetesen csak az MHCII+ monocitákban (Kiegészítő S4d ábra) és a makrofágokban volt kimutatható (nem látható). A gyulladás lefolyása során a magas Il23a expresszió fennmaradt az MHCII+ monocitákban és azok fejlődési utódaiban, de a CD103+ DC-kben nem (5a. ábra). A CX3CR1int alcsoportok között az Il23a expressziója tovább korlátozódott a CD64+ sejtekre (5b. ábra).

Az adataink együttesen azt mutatják, hogy az IL-23 indukciója a vastagbélgyulladásban a CX3CR1-et kifejező CD11c+ sejtekben található, amelyek MHCII-t és CD64-et is kifejeznek.

A Batf3-függő CD103+ DC-k nélkülözhetők a krónikus vastagbélgyulladásban

A CD103+ CD11b+ DC-k túlnyomórészt az egér vékonybélben találhatók, és szinte hiányoznak a vastagbélből.6 Ehelyett a legtöbb vastagbél CD103+ DC CD11b-, és fejlődésükhöz szükségük van a Batf3 transzkripciós faktorra.30 A Batf3-/- egerekből ezért hiányoznak a szövetrezidens CD8α+ és CD103+ CD11b- nem limfoid DC-alcsoportok. A várakozásoknak megfelelően a CD103+ CD11b- sejtek erősen csökkentek a Batf3-/- egerek vastagbél lamina proprájában, míg a CD103+ CD11b+ DC-k nem voltak érintettek (6a,b ábra). Annak felmérésére, hogy a CD103+ CD11b- DC-k részt vehetnek-e a vastagbélgyulladás kialakulásában, Batf3-/- egereket fertőztünk Hh-val, anti-IL-10R kezeléssel kombinálva. A vastagbélgyulladás megindulása után 2 héttel a CD103+ CD11b- DC-k száma még mindig jelentősen csökkent a lamina propria-ban (6b. ábra), de a leukocita-infiltrációban (6c. ábra) vagy a vastagbélgyulladás súlyosságában (6d. ábra) nem tapasztaltunk különbséget a Batf3-/- egerekben a vad típusú társaikhoz képest, ami arra utal, hogy a Batf3-függő DC-k nélkülözhetők az IL-23 által kiváltott bélgyulladás indukciójában ebben a modellben.

Az érett makrofágok IL-23-at termelnek válaszul a H. hepaticus stimulációra in vitro, de in vivo funkcionális redundanciát osztanak meg az MHCII+ monocitákkal

A makrofágok IL-23 termeléshez való hozzájárulásának megfejtésére CD11cIL-23- és CD11cIL-23+ egerekből csontvelőből származó makrofágokat (BMDM) generáltunk. Az L929 sejtekkel kondicionált médiummal történő differenciálást követően a BMDM-ek mintegy fele Cre-GFP pozitív volt, és CD64, F4/80 és CD11c-t expresszált (S5a kiegészítő ábra). A BMDM-eket in vitro stimuláltuk élő Hh-baktériumokkal anti-IL-10R antitest jelenlétében, és a válaszukat összehasonlítottuk a megfelelő kontrollokkal. Feltűnő, hogy a CD11cIL-23+ BMDM-ek Hh-val történő stimulálása Il23a mRNS-expressziót eredményezett, és ez a válasz az IL-10R jelátviteli blokkolás jelenlétében fokozódott, míg az Il23a nem fejeződött ki a nem stimulált BMDM-ekben vagy a csak anti-IL-10R antitesttel kezeltekben (S5b kiegészítő ábra). Hasonlóképpen, az egerek Hh-val történő fertőzése in vivo csak az IL-23 alacsony kitörését indukálta a monocitákban és makrofágokban, és ez a válasz erősen fokozódott az IL-10R jelátvitel hiányában (Kiegészítő ábra S5c).

A bélszöveti makrofágok kizárólag vérmonocitákból származnak, és nem újulnak meg önmaguktól.8. A bélszöveti makrofágok kizárólag a vér monocitáiból származnak, és nem újulnak meg, 10 A kolónia-stimuláló faktor 1 receptor (CSF-1R) jelátvitel szabályozza a Ly6Chi differenciálódását Ly6Clo monocitákká31 és szükséges a rezidens típusú Ly6Clo monociták és szöveti makrofágok éréséhez és cseréjéhez, de nélkülözhető a Ly6Chi monociták termelődéséhez vagy gyulladásos funkciójához.32 Az MHCII+ monociták és a szöveti makrofágok IL-23-függő bélgyulladás kialakulásához való relatív hozzájárulásának felmérése érdekében a CX3CR1GFP/+ egereket anti-CSF-1R-blokkoló mAb-vel vagy izotípus-kontrollal előkezeltük a vastagbélgyulladás indukciója előtt. Az egerek egy csoportját a 0. napon elemeztük (S6a,b kiegészítő ábra), míg a többi egeret Hh-val és anti-IL-10R-rel kezeltük, és továbbra is anti-CSF-1R kezelésben részesítettük. A Hh-fertőzést és az anti-IL-10R-kezelést követő 4. napon az anti-CSF-1R-kezelt egerek vastagbeléből szinte teljesen hiányoztak a makrofágok. A heterogén Ly6Clo CX3CR1int makrofág/DC kompartment is jelentősen csökkent ezekben az egerekben (7a,b ábra és S6c kiegészítő ábra). Bár a vastagbél leukocitáinak teljes száma nem változott (7c. ábra), a granulociták aránya növekedett ezekben a körülmények között (7d. ábra). Érdekes módon a makrofágok megfogyatkozása a 4. napon tovább korrelált az Il23a fokozott expressziójával a lamina propria belsejében (7e. ábra). Ugyanakkor a makrofágok anti-CSF-1R-mediált depletációja a vastagbélgyulladás teljes lefolyása alatt nem befolyásolta a vastagbélben felhalmozódó gyulladásos sejtek számát (7f. ábra) vagy a bélpatológia súlyosságát (7g. ábra) 2 héttel a Hh-fertőzést és az IL-10R jelátvitel blokkolását követően, ami arra utal, hogy az MHCII+ monociták és makrofágok funkcionális redundanciát mutathatnak a gyulladás során.