Adatok megtekintése
A CellProfiler Analystban a nagy, többdimenziós képalapú képernyők feltárásának kiindulópontja négyféle ábratípus (1. ábra). Fontos, hogy ezek az eszközök kompatibilisek a képalapú képernyőkön jellemzően megszerzett adatok méretarányával, amely több száz jellemzőt jelenthet több százmillió sejtenként. A hisztogramok egy mért jellemzőhöz tartozó értékek eloszlását jelenítik meg a kép- vagy objektumadatok egyenletes távolságban elhelyezkedő rekeszekbe csoportosításával, lineáris vagy logaritmikus skálán (1a. ábra). Az ilyen ábrák hasznosak lehetnek például a minták sejtciklus-állapotának vizsgálatához (a sejtenkénti DNS-tartalom ábrázolásával) vagy a kiugró értékek vizsgálatához minőségellenőrzési célokra (pl. a képenkénti sejtszám ábrázolásával). Képenként vagy objektumonként két mért jellemző megjeleníthető ugyanazon a diagramon egy szórásdiagramon keresztül (1b. ábra), ami szintén hasznos a találatok azonosításához és minőségellenőrzési célokra. A kutató például könnyen kizárhatja a fókuszon kívüli képeket az elemzésből a CellProfiler “Measure Image Quality” modulja által végzett mérések alapján. Mivel a szórásdiagramok adatpontjai elfedhetik egymást, jellemzően alkalmatlanok az egyedi sejtadatokra, ahol több százmillió adatpontot vizsgálnak az érdekes alpopulációk azonosítása érdekében. Ezekre az esetekre a sűrűségdiagram megfelelőbb (1c. ábra). A grafikon minden egyes képpontja egy hisztogram “bin”-t képvisel, és a képpont színe a binben lévő adatpontok számát jelöli. Ezek az ábrák hasznosak például olyan küszöbértékek meghatározásához, amelyeknél az egyes sejteket két jellemző alapján (pl. két intenzitásmérés alapján, mint az áramlási citometriában) “pozitívnak” vagy “negatívnak” lehet minősíteni. Az egyes képek vagy adatpontok kettőnél több mért jellemzőjének feltárásához párhuzamos koordinátadiagramot használnak. A párhuzamos koordináta-diagramok lehetővé teszik az adatok több dimenziójának elemzését, ahol minden egyes mért jellemző skálázott (0-1) értékei külön y-tengelyt kapnak, és az egyes adatpontok e több tengelyen keresztül kapcsolódnak egymáshoz (1d. ábra).
Négyféle ábrát lehet létrehozni. A CellProfiler Analyst által létrehozott ábrák négy típusa látható. (a) A képenkénti adatok hisztogramja (a képen lévő összes sejt átlagos területe). (b) A képi adatok szórásdiagramja (X-tengely = a képen lévő összes sejt átlagos területe; Y-tengely = a képen lévő összes sejtmag átlagos területe). Egy adott minta és annak replikátumai kék adatpontokként vannak kiemelve, a kék vonalak pedig az átlagtól mért +/- két standard eltérést jelzik, bár mivel az adatok nem Gauss-szerűek, a bal oldali standard eltérés vonala nem látható. (c) Az egyes sejtek adatainak sűrűségi ábrája (X-tengely = a sejt területe; Y-tengely = a sejtmag területe. (d) Párhuzamos koordinátadiagram, ahol 6 jellemzőt ábrázolunk, egyet-egyet minden számozott tengelyen a diagram alatt látható táblázatban megjelöltek szerint. A szórásdiagramon kiválasztott négy kék adatpont a párhuzamos koordináta-diagramon is kék vonalként van kiemelve. Ebből a plotból látható, hogy ez a négy adatpont nagy sejt- és magterületű (a bal szélső két koordináta), de alacsony sejtszámú (a jobb szélső koordináta).
A plot minden egyes adatpontja jelenthet egy egyedi sejtet, vagy ezzel szemben a képen belüli sejtpopuláció átlagértékét. Az adatok a minták közös jellemzői (pl. kémiai név vagy dózis) alapján is csoportosíthatók. Az azonos kezelési feltételeket (pl. kémiai vegyületek vagy RNS-interferencia-reagensek) vizsgáló több kísérlet is csoportosítható, ami megkönnyíti az ismétlések elemzését. Minden típusú ábrázolás esetén a megjelenítendő adatok szűrhetők, például úgy, hogy csak egyetlen képből származó adatokat, meghatározott egyenlő időközönként az adatpontok egy mintájából származó adatokat vagy bizonyos kritériumoknak megfelelő adatokat ábrázoljanak (SQL “where” záradékokban megadva, mint például “CellCount > 100”).
Az adatok közötti kapcsolatok feltárása
Az egyik ábrán kiválasztott és kiemelt adatpontok azonnal megjelennek az összes többi nyitott ábrán is (ezt a technikát gyakran “ecsetelésnek” nevezik), így egy minta vagy mintacsoport más mintacsoportok összefüggésében vizsgálható (2. ábra). Ez lehetővé teszi például az érdeklődésre számot tartó minták méréseinek összehasonlítását a kísérlet összes mintájával. Az ecsetelés segít a felhasználónak könnyebben megvizsgálni az adatokban lévő kapcsolatokat, különösen akkor, ha az adatok nagyszámú attribútumot vagy elemet tartalmaznak, ha az adatok több kísérletet (beleértve például a replikátumokat) ölelnek fel, vagy ha természetes, hogy az adatok különböző részeit különböző nézetek segítségével vizsgáljuk. Az ecsetelés koncepcióját a CellProfiler Analyst kiterjeszti olyan helyzetekre, amikor egyszerre több kísérletet vizsgálnak: amikor egy adott képhez tartozó pont kiemelésre kerül, az adott kísérleti kezelési feltételhez tartozó összes pont kiemelhető, még akkor is, ha az adatok több kísérletből származnak, amelyeket együttesen vizsgálnak. Az 1b. ábrán látható szórásdiagramon például négy adatpont kék színű, mert eredetileg egy volt kiválasztva, és a felhasználó kérte, hogy az adott mintára vonatkozó ismétlések is legyenek kiemelve.
Az adatok közötti összefüggések vizsgálhatók. A nagy magterületű (a képen szereplő sejtekre átlagolt) és nagy DNS-intenzitású (a képen szereplő sejtekre átlagolt) képeket ábrázoló adatpontok kékkel vannak kiemelve az a) pontban látható szórásdiagram ecsetelésével. A megfelelő pontok azonnal kék színnel jelennek meg a másik nyitott szórásdiagramon (b), lehetővé téve az összes ábrázolt jellemző közötti kapcsolat vizsgálatát. A DNS-tartalom hisztogram (c) szintén a kiválasztott képi adatpontok (kék) egyedi sejtadatait mutatja a kísérlet összes sejtjéhez viszonyítva (piros). Ebben az esetben a kiválasztott kék adatpontok valóban szokatlan sejtciklus-eloszlást mutatnak (kevesebb 2N sejt a 4N sejtekhez képest) a kísérlet összes sejtjéhez képest. Végül a kiválasztott kék adatpontoknak megfelelő minták nevei (d, “Hairpin” oszlop, ennél az adott RNS-interferencia kísérletnél) egy táblázatban megjeleníthetők, hogy lássuk, mely minták vannak jelen a kiválasztott pontokban. A táblázat első két oszlopa az a) pontban látható szórásdiagram tengelyei alapján az említett adatpontokra vonatkozó egyéb információkat mutatja. Az “ImageNumber” és a “well” oszlopok további információkat nyújtanak a kutató által vizsgált mintákról.
Az adatok vizsgálata
Az érdekes adatpontok vagy adatpontcsoportok többféleképpen vizsgálhatók az adatokba való behatolással (3. ábra). A képméréseket ábrázoló adatpontokat mutató ábrák esetében egy adatpont vagy adatponthalmaz kiválasztható, és megjeleníthetők az adatpontot létrehozó eredeti képek (3d. ábra). Ez feltárhatja a minta előkészítésében vagy a képalkotásban előforduló műtermékeket, például fluoreszkáló tesztvegyületeket, aggregátumokat vagy a festőreagensek, szálak vagy törmelék túlzott mennyiségét (3g. ábra). Ezek az artefaktumok nemcsak a tényleges sejteket takarják el a képeken, hanem megzavarhatják a képen maradó sejtek megfelelő azonosítását és mérését is. Ezen és más okokból kifolyólag a képelemzésből származó azonosítási körvonalakat mutató képek (ha rendelkezésre állnak) is megjeleníthetők a kiválasztott adatpontokhoz (3e. ábra), hogy megállapítható legyen, hogy a sejtek azonosítása megfelelően történt-e. Ez fontos szempont, mivel egyetlen szegmentáló algoritmus sem hibátlan.
Az adatpontok vizsgálhatók. A szórásdiagramon (a) kékkel kiemelt adatpontok egy adott kezelési feltétel magas átlagos sejtfelületű és magterületű ismétléseit jelentik. E minták sejtciklus-eloszlásának vizsgálatához az e négy képen belüli egyes sejtek alapján készült DNS-tartalom-hisztogramot ábrázoltuk (b). A négy adatpont egyikéhez a kutató megjelenítette az adatbázisban szereplő összes mérés táblázatát (c), a nyers képet (d), vagy a körvonalakkal átfedve (e). Minden egyes festés/csatorna (vörös, zöld, kék) be- vagy kikapcsolható, hogy a köztük lévő kapcsolatokat közelebbről is meg lehessen vizsgálni. Az egyik mintában vizsgált gént leíró nyilvános weboldalról származó információ az adatpontra kattintva megjelenítésre került (f). Bizonyos mért jellemzők (pl. magas átlagos sejtaktin-intenzitás, magas átlagos sejtterület, magas szegmentálási küszöbérték vagy a telített képpontok százalékos aránya) kiugró adatpontjai súlyos műtermékeket tartalmazó képeket jelezhetnek (g), amelyeket ki kell zárni az elemzésből. Ezeket a képeket az aberrált mérések alapján azonosítani lehet, és gatinggel (azaz az adatoknak csak egy részhalmazának kiválasztásával, amelyet ábrázolni és tovább elemezni kell) ki lehet zárni a további elemzésből.
Kiegészítésképpen egy adatpont vagy adatpontok halmaza kiválasztható, és külön aldiagramként megjeleníthető az egyes sejtek méréseinek ábrázolása, amelyek az adott képeken jelen voltak. Ez lehetővé teszi például a sejtpopuláció sejtciklus-eloszlását jelző DNS-tartalom-hisztogram megjelenítését egy adott, érdeklődésre számot tartó kép vagy képcsoport esetében (2c. ábra és 3b. ábra). Az érdekes minták azonosságának vizsgálatához az áttekintés érdekében megjeleníthető az adatpontok halmazát eredményező kezelési feltételek egyszerű listája (2d. ábra). További vizsgálat céljából az egyes képek kezelési feltételeiről webalapú információ indítható egy külső webböngészőben (3f. ábra), ha az adatbázisban az egyes mintákhoz kapcsolódó webcímek tárolva vannak. Egy adott mintára vonatkozó összes rendelkezésre álló mérés és egyéb információ megjeleníthető egy egyszerű táblázatban, és elmenthető vesszővel elválasztott szöveges fájlként egy másik szoftvercsomagban történő elemzéshez (3c. ábra).
Egyedi sejtadatok pontozása komplex fenotípusok pontozásához
A képalapú adatok óriási értéket képviselnek, mivel több egysejtes mérés áll rendelkezésre. Az egyes sejtek kezelésre adott válaszai általában inhomogének a sejtciklus-változások vagy a memória vagy a sztochasztikus zaj miatti fehérjeszintbeli különbségek miatt . Sok esetben egyetlen mért jellemző (pl. a vörös festék teljes intenzitása a sejtmagban) felhasználható az egyes sejtek pontozására, és az egyetlen kihívás a pozitív sejtek pontozására alkalmas küszöbérték meghatározása. Ez a CellProfiler Analystban az egyedi sejtadatok hisztogramjainak felhasználásával megoldható. Összetett fenotípusok esetén az egyes sejtek több jellemzője is szükséges lehet a hatékony pontozáshoz. Ezekben az esetekben az egyes sejteket bemutató sűrűségdiagram (4a. ábra) hasznos lehet az érdekes sejtszubpopulációk azonosításához, a diagram egy szakaszának körülhatárolásával (gyakran “gating”-nek nevezik). Azt, hogy a kapu tartalmazza-e az érdeklődésre számot tartó sejteket, két funkció segítségével lehet tesztelni: a “Show Object Montage” funkcióval megnézhetjük, hogy a kapun belüli egyes sejtek hogyan néznek ki (4b. ábra), és a “Show Image” funkcióval megnézhetjük, hogy egy adott mintán belüli sejtek megfelelően a kapun belül vagy kívül vannak-e jelölve (4c. ábra). Miután a sejtek végső, kívánt alpopulációjának kapuzása megtörtént, a további statisztikai elemzéshez minden egyes képre kiszámítjuk az adott alpopulációba tartozó sejtek számát (4d. ábra). Ha például a DNS és a hiszton H3 foszforilált 10-es szerinje is meg van festve, a CellProfiler Analystban egy egyszerű kétfunkciós kapu lehetővé teszi a mitotikus alfázisok pontozását a humán HT29 sejtekben (4e. ábra). Sok szoftverrendszer a képelemzést menet közben, a képfelvétel során végzi; ilyen esetekben a képernyő pontozásához előre meg kell választani egy küszöbértéket az érdeklődésre számot tartó jellemzőhöz. Ezzel szemben a CellProfiler Analyst ezen eszközei lehetővé teszik a különböző jellemzők és különböző mérési küszöbértékek alapján történő pontozás hatékonyságának tesztelését.
A sejtek alpopulációit azonosítani, vizsgálni és pontozni lehet. (a) Az egyes sejtek adatainak sűrűségdiagramján (log-skála: X-tengely = a nukleáris DNS integrált intenzitása; Y-tengely = nukleáris terület), két populációt gatelizáltunk (fehér dobozok), és az egyes alpopulációkon belül a sejtek véletlenszerű kiválasztása látható a jobb oldali montázsokban (b); az adott mintában jelen lévő összes gatelizált sejt is jelölhető (c). A minták pontozhatók (d) az egyes mintákban található gated sejtek és az összes sejt száma, az adott százalékos arány feldúsulása az egész kísérlet pozitív sejtjeinek teljes százalékához képest (“Enrichment”; például a táblázatban felsorolt első képen 19,311-szer több sejt található az alpopulációban, mint a kísérletben összességében jellemzően), valamint a bal és jobb oldali log10 p-értékek (a feldúsulás statisztikai szignifikanciájának mértéke a mintában lévő sejtek száma alapján). (e) Az anafázis/telopfázis és a késői profázis/metafázis kapui (az adatokat a kísérletben szereplő összes humán HT29 sejtre vonatkozóan ábrázoltuk . X-tengely = a DNS integrált nukleáris intenzitása, log-skála; Y-tengely = a foszfo-hiszton H3 átlagos nukleáris intenzitása). A kapukon belül eső véletlenszerű sejtek minden 34 x 34 mm-es részkép közepén láthatóak.
Ha egy fenotípus pontozásához kettőnél több jellemzőre van szükség, a sejtadatokon szekvenciális kapukat lehet használni. Ezt a megközelítést a következőképpen alkalmazzuk: (1) egy kísérletből származó teljes sejtpopuláció megjelenítése egy sűrűségdiagramon, (2) egy kapu rajzolása a potenciálisan érdekes sejteket reprezentáló adatpontok köré, (3) a kapu beállítása úgy, hogy szinte az összes pozitív sejtet tartalmazza, és a lehető legtöbb negatív sejtet kizárja, (4) az így kapott kapuzott részpopuláció ábrázolása egy új sűrűségdiagramon két új mérési jellemzővel mint tengelyekkel, (5) az új jellemzők alapján az alpopuláció újbóli kapuzása, és (6) az egyes képek sejtjeinek a végső kapun belüli százalékos arányának kiszámítása.
Egy esettanulmány: mitotikus alfázisok szűrése
Motiváció
A CellProfiler Analyst azon képességét kívántuk tesztelni, hogy az egyedi sejtadatok ábrázolására, feltárására és szűrésére alkalmas, több morfológiai jellemző által meghatározott alpopulációk azonosítására. Úgy döntöttünk, hogy Drosophila melanogaster Kc167 sejteket azonosítunk a sejtciklus telopázisában és metafázisában, kizárólag DNS-festéssel. A perturbált sejtciklus-szabályozással rendelkező minták azonosítása egyértelműen fontos a normál sejtbiológia és a rákkutatás szempontjából egyaránt. A sejtciklus szabályozóit évtizedek óta intenzíven keresik hagyományos és nagy áteresztőképességű szűrésekkel a sejtciklus általános eloszlásában bekövetkező változások vagy a késői G2 és M fázisban lévő sejtek markerének, a foszfo-hiszton H3 festődésnek a megnövekedett szintje után (pl. és az ottani hivatkozások). Arra gondoltunk, hogy további olyan gének is létezhetnek, amelyek perturbációja a metafázis- vagy telopházis-stádiumban lévő sejtmagok számának növekedését eredményezi anélkül, hogy lényegesen befolyásolná az általános mitotikus indexet (foszfo-hiszton H3 festődés) vagy a sejtciklus eloszlását. Bár nem volt tudomásunk ilyen fenotípussal rendelkező pozitív kontrollokról, gyanítottuk, hogy az ilyen géneket korábban figyelmen kívül hagytuk, mert észrevettük, hogy ismeretlen okokból nem minden metafázisú sejtmag festődik fényesen foszfo-hiszton H3-ra (5a. ábra). Az első lépés lenne e jelenségek megértése felé, ha azonosítanánk azokat a géneket, amelyek RNAi hatására a mitózis bizonyos alfázisaiban lévőnek tűnő sejtek keletkeznek, függetlenül az egyidejű foszfo-hiszton H3 festődéstől.
Drosophila sejtmikroarrays. (a) A foszfo-hiszton H3 festődés gyakran halvány a metafázisú sejtmagok esetében (balra és középen vs. jobbra). Méretsáv = 5 μm. (b) Egy sejttömb, DNS-festéssel és kontraszterősítéssel (5× objektív). Méretsáv = 5 mm. (c) Az (a) kis metszete, a tömb 4 foltját jelölő körökkel. Méretsáv = 100 μm. (d) Nagy felbontású kép (40× lencse) a tömb egy pontján belülről, Hoechsttel (kék, DNS) és falloidinnal (zöld, aktin) festve. Skálasáv = 5 μm.
Már több csoport is tesztelt automatizált módszereket a mitotikus alfázisok pontozására ; ezeket a vizsgálatokat az adott vizsgálatra szabott számítási eszközökkel végezték, és gyakran több sejtfestékre támaszkodtak. A gépi tanulási módszereket saját csoportunk és mások is vizsgálták (lásd a Következtetéseket), de azt is meg akartuk vizsgálni, hogy a felhasználó kézzel kiválaszthasson néhány ismert biológiai relevanciájú jellemzőt, majd ezeket a jellemzőket szekvenciális kapuzás kövesse. Ez teljes ellenőrzést biztosítana a kutatónak a pontozáshoz használt jellemzők felett, és a pontozás könnyebben átvihető lenne egyik kísérletről a másikra, mivel kis számú jellemzőt választunk ki. Ezért a mitotikus alfázisok pontozását csak DNS-festék használatával, a mérések felügyelt kiválasztásával, majd az ezeken a méréseken végzett szekvenciális gatinggel kívántuk elvégezni, egy olyan szoftvercsomag keretében, amelyet egy nem informatikus tudós is használhat.
Image scoring by sequential gating of individual cell data
Drosophila RNS-interferencia élősejt-mikrotáblák segítségével olyan gének szűrését végeztük el, amelyek a mitózis két alfázisában: a metafázisban és az anafázis/telopházisban (az egyszerűség kedvéért telopházisnak nevezzük) aránytalanul sok sejtet eredményeznek. Egy Drosophila array 5 replikátumát hoztuk létre és elemeztük, 1120 dsRNS-foltot tartalmazva egyetlen mikroszkópos tárgylemezen (5b. ábra), beleértve 288 gén (főként kinázok és foszfatázok) mindegyikének három replikátumát, valamint 256 dsRNS-t nem tartalmazó negatív kontrollfoltot. Néhány, ezekben a Drosophila Kc167 sejtekben létrehozott fenotípus (pl. sejthalál) alacsony felbontásban látható (5× objektív; 5c. ábra), de a telopáz és metafázis sejtmagok azonosításához minden egyes folton belül nagy felbontású egyedi képeket gyűjtöttünk minden egyes tárgylemezen (40× objektív; egy kép kis része látható az 5d. ábrán).
A telopáz fenotípussal kezdtük. Annak meghatározásához, hogy mely mért sejtjellemzők lennének a leghatékonyabbak a pontozáshoz, kézzel kiválasztottunk reprezentatív telopáziás sejtmagokat és normál G2-fázisú sejtmagokat a véletlenszerű szűrési képekből, és Adobe Photoshop segítségével képmontázsokat készítettünk e két osztály számára (6a. ábra). A CellProfiler segítségével megmértük a nukleáris jellemzőket ezekben a montázsképekben, majd az eredményeket Excelbe exportáltuk, és kiválasztottunk öt jellemzőt a szekvenciális kapuzáshoz, a biológiai intuíció és az egyes jellemzők kvantitatív képességének kombinációja alapján, hogy egyszerű statisztikai tesztek segítségével az Excelben megkülönböztessük a telopáziás magokat a normál magoktól. A kiválasztott jellemzők közé tartoztak a DNS-tartalom, az intenzitás, az alak és a textúra jellemzői (kiegészítő adatfájl 1).
A képernyő a telopáz- és metafázis-stádiumú sejtmagokban feldúsult RNS-interferenciás mintákat mutatott ki. (a) Kézzel kiválasztott Drosophila Kc167 sejtmagok kompozit képei, amelyeket a jellemzők kiválasztásának irányítására és a kapuk kifejlesztésének kiindulópontjaként mértünk. A kompozit kép egyes alpaneljeinek szélein lévő egyéb sejtmagokat kizártuk az elemzésből. (b) Az automatikusan pontozott sejtmagok véletlenszerű mintája a sejtmikrotáblákból. A pontozott sejt az egyes panelek közepén található, kivéve, ha a sejt a kép széléhez közel volt. Méretsávok = 5 μm. (c) Azok a gének, amelyek dsRNS-e jelentősen növeli a telopázisban (első négy sor) vagy metafázisban (utolsó sor) lévő sejtek arányát. Kizártunk egy gént (CG3245), amely eredetileg telopáziás találatként szerepelt, mert a vizuális vizsgálat azt mutatta, hogy az egyik képen törmelék volt, amely megzavarta a megfelelő elemzést. Megjegyzendő, hogy a CG8878 nem tekinthető telophase-specifikusnak (lásd a szöveget). A negyedik oszlop az egyes DNS-tartalmú sejtek százalékos arányának (2N, 4N vagy 8N) és a teljes sejtek számának összességében bekövetkezett hajtásváltozásait mutatja, a szignifikáns különbségeket a tömbön vizsgált összes génhez képest csillaggal jelölve. A sejtciklus-eloszlás e képalapú elemzésének részleteit lásd az Anyagok és módszerek részben. Az ötödik oszlop a foszfo-hiszton H3-pozitív sejtek százalékos arányának megdúsulását mutatja, a sejtmagban lévő festődés átlagos intenzitását használva, két ismétlés átlaga alapján. Az utolsó oszlopban hivatkozott hivatkozások: A , B , C , D , E , F , G .
Ezután interaktív módon szekvenciális kapukat fejlesztettünk ki a CellProfiler Analystban e jellemzők sűrűségi ábráinak felhasználásával (lásd “Egyedi sejtadatok kapuzása komplex fenotípusok pontozásához” című részt). E feladat elvégzéséhez a CellProfiler programot használtuk a teljes szűrési képkészlet feldolgozására és az így kapott adatok adatbázisba való betöltésére (2,8 millió sejt × 396 jellemző/sejt = összesen 1,1 milliárd mérés). Ez lehetővé tette számunkra, hogy a kísérletben szereplő összes egyedi sejtet egy kezdeti sűrűségdiagramban jelenítsük meg, amelynek tengelye két általunk kiválasztott jellemző, azaz a DNS-tartalom és a sejtmag mérete (területe). Egy kezdeti kaput rajzoltunk a 2N DNS-tartalom-csúcs és a kis magterület köré, és empirikusan finomítottuk a kaput a telopházisban lévő sejtek esetében a bekapcsolt sejtmagokról készült képek vizsgálatával és a kapu határainak megfelelő beállításával. Míg az automatizált megközelítések minden bizonnyal azonosíthatnának egy határt a kutató által biztosított tréningkészlet alapján, ez a kézi megközelítés lehetővé teszi a biológus számára, hogy a releváns határok közelében számos sejtet célzottan értékeljen. Miután kiválasztották a megfelelő kaput a kezdeti sűrűségdiagramhoz, az alpopulációt átvitték egy új sűrűségdiagramra, amelynek tengelyeként két új jellemzőt használtak, és létrehozták a következő kaput, ismét megtalálva az optimális paramétereket a telopházisú sejtmagok és az összes többi sejtmag megkülönböztetéséhez. Ezt az eljárást megismételtük az ötödik és egyben utolsó kiválasztott jellemzőre. Miután a végső kaput finomítottuk, a szekvenciális kapukat egy új képsorozatra alkalmaztuk, és megerősítettük, hogy a pontozásuk hatékony volt (1. táblázat és 6b. ábra), és sikeresen megkülönböztette a telopázist a többi sejtmagtól. A kapuk létrehozásakor arra törekedtünk, hogy minimalizáljuk a hamis pozitív arányt, ugyanakkor elfogadjuk a magasabb hamis negatív arányt (1. táblázat). Úgy gondoltuk, hogy a valódi találatoknak elegendő pozitív eredményük lesz ahhoz, hogy legyőzzük ezt a szándékosan szigorú szelekciós eljárást. Ezen a ponton alkalmaztuk a végső szekvenciális kapukat az összes sejtre, hogy a teljes szűrést pontozzuk a telophase fenotípus szempontjából. Megállapítottuk, hogy a kapukat a különböző ismétlődő fóliák között jellemzően kissé módosítani kell a kísérletek közötti variabilitás miatt (pl, festési intenzitás), bár a kísérletenkénti normalizálási módszereket meg lehet vizsgálni ennek a hatásnak a csökkentésére.
A metafázis fenotípusra külön elvégeztük ugyanezt az eljárást (négy jellemzőt használva a metafázisos sejtmagok megkülönböztetésére az összes többi sejtmagtól); a 288 vizsgált gén teljes listája és a télfázisra és metafázisra kapott pontszámok a 2. kiegészítő adatállományban találhatók.
Telophase-elemzés
A minták rangsorolása a telophase-magok százalékos aránya alapján 4 olyan gén kiütését mutatta ki, amely szignifikánsan növelte a telophase-magok számát (6c. ábra, első 4 sor). A megközelítést validálva, a gének közül kettő olyan PP2A komplex alegység, amelyet korábban már kapcsolatba hoztak a mitózissal: a PP2A-C katalitikus alegység mts (CG7109/microtubule star) és a PP2A-A család szabályozó alegysége (CG17291/CG33297/CG13383, Megjegyzés: dicistronikus a CSN8-cal). A mindkét gén elleni RNSi növelte a foszfo-hiszton H3-pozitív sejtek százalékos arányát (6c. ábra, ötödik oszlop). Egy harmadik találatot, a Ck1α-t (Casein kinase 1α/CG2028) korábban szintén a mitózissal hozták összefüggésbe (6c. ábra, utolsó oszlop). Megfigyeltük, hogy RNSi-vel történő kiütése olyan sejtmagokat eredményezett, amelyek kromatinja valamivel kevésbé tűnt kondenzáltnak, mint a tipikus telopáziás sejtmagoké (7. ábra), miközben még mindig jobban kondenzált, mint az interfázisú sejtmagoké. A foszfo-hiszton H3-pozitív sejtek aránya normális volt (6c. ábra, ötödik oszlop). Ezek a megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy ez a hiba a telopáz/anafázis késői szakaszában jelentkezik. A negyedik találat egy funkcionális annotációval nem rendelkező prediktált kináz volt (CG8878). A vizuális vizsgálat azt mutatta, hogy ezekben a mintákban szinte minden sejtmag fényesebbnek és tömörebbnek tűnt, mint a kontrolloké, ami egy finom, de reprodukálható hatás (7. ábra). Ez érthető módon azt eredményezte, hogy a 2N sejtmagok közül többet számoltak telophase-szerű morfológiával rendelkezőnek. Azt találtuk, hogy ezek a sejtek nem voltak foszfo-hiszton H3-pozitivitásban gazdagodva (6c. ábra, ötödik oszlop); további kísérletek nélkül nem világos, hogy ez egy valódi késői mitotikus fenotípus vagy inkább egy kondenzált sejtmag fenotípus.
Szokatlan fenotípusokat találtunk a CG2028 és a CG8878 telopházisú találatok esetében. Fent: A CG2028 knockdown sok telophase-szerű sejtmagot eredményez, amelyek kevésbé kondenzáltnak tűnnek, mint a tipikus telophase sejtmagok, de jobban kondenzáltnak, mint az interfázisú sejtmagok. Alul: A CG8878 mintából származó majdnem minden sejtmag kondenzáltabb, mint a kontrolloké. A két gén tárgyalását lásd a szövegben. Méretsáv = 20 μm.
Metafáziselemzés
Érdekes, hogy az egyetlen metafázis találat ebben a szűrésben (6c. ábra, utolsó sor) a PP2A B’/B56 alcsalád szabályozó alegysége (CG5643/widerborst), amelyet a szűrésünk idején még nem hoztak kapcsolatba a sejtciklus szabályozásával. A foszfo-hiszton H3-pozitív sejtek aránya nem volt sokkal magasabb a normálisnál (6c. ábra, ötödik oszlop). Szemmel megerősítettük a widerborst knockdown metafázis-indukáló fenotípusát az eredeti felvételeken és két másik dsRNS-sel végzett külön kísérletekben, köztük egy olyanban, amely nem volt átfedésben az eredetivel (8a. ábra). A Widerborst egy esszenciális gén, amely részt vesz a planáris sejtpolarizációban és az apoptózisban . Figyelemre méltó, hogy más összefüggésekben (cirkadián órafehérje-ciklus és érzékszervi fejlődés ) a widerborst közvetve kapcsolódik a B/PR55 alcsalád twins/aar tagjához, amelyről ismert, hogy maga is szükséges a metafázis-anafázis átmenethez . Munkánk tehát nem átfedő dsRNS-ekkel megerősíti a widerborst nemrégiben bejelentett sejtciklus-szabályozó szerepét, és együttesen azt jelzi, hogy nem valószínű, hogy ez a fenotípus off-target hatásoknak köszönhető .
A widerborst legközelebbi humán homológja a PPP2R5E, a PP2A komplex PP2R5 (más néven B’/PR61/B56) szabályozó alegységeinek egyik alcsaládjának epsilon izoformája. A PPP2R5E-hez egyelőre nem társítottak különösebb funkciót. Arra gondoltunk, hogy a PPP2R5E lehet-e olyan B’ szabályozó alegység, amely modulálja a PP2A ismert szerepét a mitózisban, tekintettel arra, hogy homológjának, a widerborstnak a Drosophilában betöltött szerepére. A PPP2R5E kiütése nem növelte szignifikánsan a mitotikus indexet a megnövekedett foszfo-hiszton H3 foszfo-hiszton H3-ra vonatkozó legújabb RNS interferencia szűrésekben . Amikor azonban ugyanezeket a PPP2R5E-knockdown képeket a foszfo-hiszton H3 szint helyett a metafázis morfológia szempontjából pontoztuk, a PPP2R5E knockdown esetében metafázis-megállási fenotípust fedeztünk fel, amit két különböző shRNS-sel is megerősítettünk (8b. ábra), ami összhangban van a Drosophila widerborst esetében megfigyelt fenotípussal. Azt, hogy a widerborst/PPP2R5E önmagában szükséges-e a metafázis-anafázis átmenethez, vagy a kimerülésük a fenotípust a megfelelő PP2A komplex sztöchiometriájának specifikus megzavarásával okozza, még meg kell határozni. A legutóbbi eredmények, miszerint a PPP2R5E a centromerekhez lokalizálódik, és hogy a szabályozó alegységek B’ alcsaládja szükséges a megfelelő meiotikus testvérkromatid-szeparációhoz hasadó és bimbózó élesztőben, alátámasztják azt az elképzelést, hogy az alegységek ezen családja valóban fontos a megfelelő kromatin dinamikához a sejtosztódás során.
A widerborst RNS-interferencia metafázismegállás fenotípusa megerősítést nyert Drosophila és emberi sejtekben. (a) A widerborst knockdown által létrehozott metafázisú sejtmagok mintavétele Drosophila Kc167 sejtekben (felül). Méretsáv = 5 μm. A metafázisú sejtmagok megnövekedett százalékos arányának kvantitatív megerősítése, két vak megfigyelő által értékelve (alul). A sávok csillaggal vannak jelölve, ha p < 0,05. Hibasávok = SEM. A kontrollok a dsRNS-t nem tartalmazó közeli foltok. (b) A PPP2R5E kopogtatásával keletkezett metafázisú sejtmagok mintavétele humán HT29 sejtekben (fent). Méretsáv = 10 μm. Kvantitatív megerősítés (alul). A sávok csillaggal vannak jelölve, ha p < 0,001. Hibasávok = SEM. A fertőzési arány a sejtek számának aránya puromicinnel, a szelekciós ágenssel, illetve anélkül. A kontroll shRNS az FLJ25006 (NMid = NM_144610).
.