Amerikai és kanadai látogatók, kérjen INGYENES mintát a CTAB alapú SYNERGY™ 2.0 növényi DNS extrakciós készletünkből ITT.
A DNS izolálása növényi szövetekből nagy kihívást jelenthet, mivel az eltérő növényi fajok közötti biokémiai különbségek extrémek lehetnek. Ellentétben az állati szövetekkel, ahol a különböző fajokból származó azonos szövettípusok általában hasonló jellemzőkkel rendelkeznek, a növényekben a metabolitok és a strukturális biomolekulák szintje változó lehet. A poliszacharidok és a polifenolok a növényi biomolekulák két olyan osztálya, amelyek nagymértékben eltérnek a fajok között, és nagyon problematikusak a DNS izolálása során. A szennyező poliszacharidok és polifenolok zavarhatják a DNS izolálást követő manipulációját.
Módszerek állnak rendelkezésre, amelyek hatékonyan eltávolítják a poliszacharidokat és polifenolokat a növényi DNS-készítményekből. A CTAB (cetil-trimetil-ammónium-bromid), egy kationos detergens használata megkönnyíti a poliszacharidok elválasztását a tisztítás során, míg az adalékanyagok, mint például a polivinil-pirrolidon, segíthetik a polifenolok eltávolítását. A CTAB alapú extrakciós puffereket széles körben használják a növényi szövetekből származó DNS tisztításakor.
A DNS tisztításának egyik lehetősége a CTAB használatával kihasználja, hogy a poliszacharidok és a DNS a nátrium-klorid koncentrációjától függően eltérő oldhatósággal rendelkeznek a CTAB-ban. Nagyobb sókoncentrációban a poliszacharidok oldhatatlanok, míg alacsonyabb koncentrációban a DNS oldhatatlan. Következésképpen a CTAB-ot tartalmazó lizátokban a sókoncentráció beállításával a poliszacharidok és a DNS differenciáltan kicsaphatók.
A polifenolok olyan vegyületek, amelyek egynél több fenolos gyűrűt tartalmaznak (pl. tannin), egy olyan szerkezetet, amely nagyon hatékonyan kötődik a DNS-hez. Természetes módon előfordulnak a növényekben, de a növények szövetkárosodásakor (barnulás) is keletkeznek. A növényi szövetek homogenizálásakor a polifenolokat a felszabaduló polifenol-oxidáz szintetizálja. A polivinil-pirrolidon hozzáadása a polifenolok megkötésével megakadályozza a DNS és a fenolgyűrűk kölcsönhatását.
A CTAB-alapú protokollok általában nagyon jól működnek, de egyik jelentős hátránya, hogy a szerves oldható molekulák DNS-től való elválasztására rutinszerűen kloroformos extrakciókat alkalmaznak. Mivel a kloroform rákkeltő, sok intézmény elítéli a használatát. Ezért az OPS Diagnostics kifejlesztett egy alternatív módszert, amely elkerüli a kloroformot; ez megtalálható a Synergy™ Plant DNA Extraction Kit oldalán.
Materials
- CTAB puffer: 2% cetil-trimetilammónium-bromid, 1% polivinil-pirrolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, vagy CTAB extrakciós puffer
- Centrifuga (14 000 x g-ig)
- RNase A oldat
- Isopropanol
- 70% etanol
- 2 ml-es centrifugacsövek
- SpeedVac
- TE puffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Módszer
A növényi mintákat úgy lehet előállítani, hogy a szöveteket folyékony nitrogénben történő hűtés után mozsárban és mozsárban kriogén módon megőröljük. A fagyasztva szárított növények szobahőmérsékleten is őrölhetők. Mindkét esetben finom por a legjobb a DNS kivonásához.
- Minden 100 mg homogenizált szövethez 500 µl CTAB extrakciós puffert használjunk. Keverje össze és alaposan vortexelje. Vigye át a homogenátumot 60 °C-os fürdőbe 30 percre.
- Az inkubációs időt követően centrifugálja a homogenátumot 5 percig. 14 000 x g-n.
- A felülúszót tegye át egy új csőbe. Adjunk hozzá 5 µl RNáz A oldatot, és inkubáljuk 37 °C-on 20 percig
- Adjunk hozzá azonos térfogatú kloroform/izoamilalkoholt (24:1). Vortexeljük 5 másodpercig, majd centrifugáljuk a mintát 1 percig 14 000 x g-n a fázisok szétválasztásához. A vizes felső fázist tegyük át egy új csőbe. Ismételje meg ezt az extrakciót, amíg a felső fázis tiszta nem lesz.
- A felső vizes fázist vigyük át egy új csőbe. Precipitálja a DNS-t 0,7 térfogat hideg izopropanol hozzáadásával, és inkubálja -20°C-on 15 percig.
- Centrifugáljuk a mintát 14 000 x g-n 10 percig. Dekantáljuk a felülúszót a pellet megzavarása nélkül, majd mossuk át 500 µl jéghideg 70%-os etanollal. Dekantáljuk az etanolt. A maradék etanolt SpeedVac-ben történő szárítással távolítsuk el.
- Szárítsuk a pelletet elég hosszan ahhoz, hogy eltávolítsuk az alkoholt, de anélkül, hogy a DNS-t teljesen kiszárítanánk. Oldjuk fel a DNS-t 20 µl TE-pufferben (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). A pelletnek melegítésre lehet szüksége ahhoz, hogy feloldódjon.
Választható protokoll:
A szilika spin oszlopok használata jobb minőségű DNS-t eredményezhet. Az opcionális protokollért kattintson ide.