Dideoxinukleotid

A nukleofil támadás gátlása a 3′-OH csoport hiánya miatt

A Sanger-módszer a DNS egy célszegmensének felerősítésére szolgál, így a DNS-szekvencia pontosan meghatározható. A ddNTP-k beépítése a reakciószelepekbe egyszerűen a növekvő DNS-szál szintézisének befejezésére szolgál, ami részlegesen replikált DNS-fragmentumokat eredményez. Ennek oka, hogy a DNS-polimeráznak szüksége van a növekvő lánc 3′ OH-csoportjára és a beérkező dNTP 5′ foszfátcsoportjára a foszfodiészterkötés létrehozásához. Előfordul, hogy a DNS-polimeráz beépít egy ddNTP-t, és a 3′ OH-csoport hiánya megszakítja a kondenzációs reakciót a bejövő nukleotid 5′ foszfátja (a pirofoszfát lehasadását követően) és a növekvő szál előző nukleotidjának 3′ hidroxilcsoportja között. Ez a kondenzációs reakció normális esetben egy nem módosított dNTP DNS-polimeráz általi beépítésével jönne létre. A legegyszerűbben fogalmazva, a 3′ OH-csoport nukleofil támadása egy nukleotid hozzáadásához vezet a növekvő lánchoz. A 3′ hidroxilcsoport hiánya gátolja ezt a nukleofil támadást, és így a DNS-polimeráz nem képes folytatni a működését.

Ez a felfedezés vezetett a megfelelő “láncvégző nukleotidok” elnevezéshez. A dideoxiribonukleotidok nem rendelkeznek 3′ hidroxilcsoporttal, ezért nem történhet további láncnyúlás, ha ez a dideoxinukleotid a láncon van. Ez a DNS-szekvencia megszűnéséhez vezethet. Így ezek a molekulák képezik a DNS-szekvenálás dideoxilánc-megszakítási módszerének alapját, amelyről Frederick Sanger és csapata 1977-ben számolt be a korábbi munka kiterjesztéseként. Sanger megközelítését 2001-ben a DNS-fragmentumok szekvenálására szolgáló két alapvető módszer egyikeként írták le (a másik a Maxam-Gilbert-módszer), de a Sanger-módszer a “legszélesebb körben használt és a legtöbb automatizált DNS-szekvenáló által használt módszer”. Sanger 1980-ban nyerte el második kémiai Nobel-díját, amelyet Walter Gilberttel (“a nukleinsavak bázissorrendjének meghatározásával kapcsolatos hozzájárulásukért”) és Paul Berggel (“a nukleinsavak biokémiájával kapcsolatos alapvető tanulmányaiért, különös tekintettel a rekombináns DNS-re”) osztott meg, és Nobel-előadásában a dideoxinukleotidok felhasználásáról beszélt.

DNS-szekvenálásSzerkesztés

A dideoxinukleotidok az elektroforézissel kombinált DNS-szekvenálásban hasznosak. A mind a négy dezoxinukleotidot és egy dideoxinukleotidot tartalmazó keverékben PCR-nek (polimeráz láncreakció) alávetett DNS-mintából a dideoxinukleotidot tartalmazó típus minden egyes bázisának pozíciójával megegyező hosszúságú szálak keletkeznek. A PCR-ben használt taq-polimeráz a ddGNTP-t részesíti előnyben, ez egy különböző kutatások során megfigyelt minta. Vagyis az adott típus minden egyes nukleotidbázisa nagy valószínűséggel nem egy dezoxinukleotidhoz, hanem egy dideoxinukleotidhoz kötődik, ami véget vet a láncnyúlásnak. Ezért, ha a mintát ezután elektroforézisnek vetik alá, minden olyan hossznál, ahol a dideoxinukleotid komplementje jelen van, egy sáv lesz jelen. Ma már elterjedt a fluoreszcens dideoxinukleotidok használata úgy, hogy a négy közül mind a négynek más-más a fluoreszcenciája, amit egy szekvenálóval ki lehet mutatni; így csak egy reakcióra van szükség.

.

Szólj hozzá!