Integrin CD11b activation drives anti-tumor innate immunity

Integrin CD11b regulates macrophage polarization

Korábban beszámoltunk arról, hogy a VCAM receptor integrin α4β1 elősegíti a myeloid sejtek toborzását a csontvelőből a tumor mikrokörnyezetébe, ezáltal serkenti az immunszupressziót, az angiogenezist és a tumor progresszióját2,13,14,15. Az akut gyulladás során a myeloid sejtek szövetekbe történő toborzásának szabályozásában betöltött szerepével ellentétben16,17,18 azt találtuk, hogy a CD11b (αMβ2), az ICAM-1 és a fibrinogén myeloid sejtek integrinreceptora nem befolyásolja a myeloid sejtek tumorokba történő toborzását, mivel a CD11b globális deléciója Itgam-/- egerekben nem befolyásolja a keringésben lévő myeloid sejtek számát vagy a tumorokba toborzott sejtek számát (1. kiegészítő ábra; 2a-d kiegészítő ábra). Meglepő módon azonban azt találtuk, hogy az integrin CD11b alapvető szerepet játszik a makrofág-polarizáció szabályozásában. Az Itgam-/- makrofágok a WT makrofágokhoz képest fokozott immunszuppresszív gén- és fehérjeexpressziót, és erősen csökkent pro-inflammatorikus gén- és fehérjeexpressziót mutattak, akár alap-, akár IL-4, akár IFNγ/LPS stimulációs körülmények között stimulálták őket (1a. ábra, 2e-f. kiegészítő ábra). Annak megállapítására, hogy a CD11b in vivo is szabályozza-e a makrofágok polarizációját, F4/80 + TAM-okat izoláltunk és jellemeztünk Itgam-/- és WT egerekben tenyésztett LLC tumorokból. Azt találtuk, hogy az Itgam-/- TAM-ok az immunszuppresszióval és az angiogenezissel kapcsolatos mRNS-ek, mint például az Arg1, Tgfb, Il10, Il6 és Pdgfb szignifikánsan magasabb szintjét, és az immunstimulációval kapcsolatos gének, mint például az Ifng, Nos2 és Tnfa szignifikánsan alacsonyabb szintjét fejezik ki, mint a WT TAM-ok (ábra. 1b, 2g. kiegészítő ábra).

Fontos, hogy a CD11b átmeneti siRNS-mediált kiütése in vitro tenyésztett makrofágokban megemelte az immunszuppresszív gének expresszióját és csökkentette az immunstimuláló gének expresszióját, ami a CD11b delécióhoz hasonló hatású (1c. ábra), ami azt jelzi, hogy a CD11b átmeneti elvesztése is szabályozza a makrofágok immunszuppresszív gének expresszióját. Annak eldöntésére, hogy a CD11b expressziója vagy funkciója szabályozza-e a makrofág génexpressziót, megvizsgáltuk a gátló CD11b antitestek hatását a makrofág mRNS-expresszióra. Az egér makrofágok CD11b által közvetített ICAM-1 bevonatú szubsztrátumokhoz való kötődésének anti-CD11b semlegesítő antitestekkel történő blokkolása szintén immunszuppresszív mRNS-expressziót indukált a makrofágokban (1d. ábra). Hasonlóképpen, a makrofágoknak az integrin α4β1 szubsztráthoz, a VCAM-1-hez való tapadása vagy a tapadás elvesztése szuszpenziós tenyésztéssel elősegítette az egér és humán immunszuppresszív transzkripciót, míg az ICAM-1 bevonatú felületekhez való tapadás az immunstimuláló transzkripciót (ábra. 1e, f, 1h kiegészítő ábra), ami azt jelzi, hogy a CD11b ligálása szabályozza az immunstimuláló makrofág transzkripciót.

A pro-inflammatorikus citokin expresszió elvesztése Itgam-/- makrofágokban arra utalt, hogy a CD11b szabályozhatja a pro-inflammatorikus transzkripciós faktorok, például az NFκB aktiválását. Azt találtuk, hogy az Itgam-/- makrofágok csökkent NFκB szerin 536 foszforilációt mutattak (ami a csökkent aktivációt jelzi19) LPS stimulációra válaszul a WT makrofágokhoz képest, ami arra utal, hogy a CD11b szerepet játszik az NFκB aktivációban (1g ábra). Mivel más tanulmányok a CD11b-t a monociták és dendritikus sejtek pro-inflammatorikus válaszainak elősegítésében az LPS-nek az integrin béta2 extracelluláris doménekkel való közvetlen kölcsönhatásán keresztül mutatták ki20,21 , eredményeink arra utalnak, hogy a CD11b aktivációja és jelátvitele kulcsszerepet játszik a makrofágok polarizációjának szabályozásában in vitro és in vivo.

A makrofág CD11b szabályozza a tumor növekedését

Adataink azt mutatják, hogy az Itgam-/- csontvelőből származó és a tumorhoz kapcsolódó makrofágok immunszuppresszívebb transzkripciós profilt mutatnak, mint a WT makrofágok. Annak megállapítására, hogy ez a különbség befolyásolja-e a tumor növekedését, adoptív módon WT vagy Itgam-/- csontvelőből származó vagy tumorasszociált makrofágokat vittünk át tumorsejtekkel együtt recipiens WT vagy Itgam-/- egerekbe. Korábban kimutattuk, hogy az adoptáltan átvitt, immunszuppresszív BMDM-ek vagy TAM-ok képesek serkenteni a tumor növekedését9,10. Figyelemre méltó módon a csontvelőből származó Itgam-/- makrofágok (1h ábra), valamint a tumorból származó Itgam-/- makrofágok (1i ábra) mind WT, mind Itgam-/- egerekben a WT makrofágokhoz képest erősen serkentették a tumor növekedését. Mivel az Itgam-/- makrofágok immunszuppresszív transzkripciós profilt mutatnak (1b. ábra), és az Itgam-/- egerekből származó tumorok általános immunszuppresszív transzkripciós profilt mutatnak (1j. ábra), ezek az adatok azt sugallták, hogy a CD11b expresszió vagy aktiváció hatással lehet a tumor általános növekedésére. Valóban azt találtuk, hogy a szubkután (LLC), ortotópos (melanoma) és autochton (PyMT) tumorok agresszívebben növekedtek Itgam-/- egerekben, mint WT egerekben (1k ábra). Mivel az Itgam-/- egerek lényegesen több CD4+ Foxp3+ Treg-et és kevesebb CD8+ T-sejtet mutattak a tumorokban, mint a WT egerek (3a-b kiegészítő ábra), vizsgálataink alátámasztják azt a következtetést, hogy a CD11b kulcsszerepet játszik a tumorok általános immunválaszának szabályozásában.

A korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a CD11b molekulában lévő 332 izoleucin alloszterikus kapcsolóként szolgál, amely az adhéziós receptor aktivációját és alakját szabályozza22. Annak megállapítására, hogy a CD11b aktivációja kontrollálja-e a tumorok kialakulását, konstitutívan aktivált CD11b knockin egértörzset (C57BL/6 ITGAMI332G) hoztunk létre egy I332G pontmutáció bevezetésével az egér Itgam génjébe. Az I332G knockin egerek normális szinten expresszálják a sejtfelszíni CD11b-t mind a monocitákon, mind a granulocitákon, és normális szinten mutatják az összes vérsejt szintjét (3c-d. kiegészítő ábra). Az ezekből az egerekből származó csontvelőből származó makrofágokkal végzett in vitro adhéziós vizsgálatok azt mutatták, hogy az I332G sejtek konstitutívan aktív CD11b-t expresszálnak (3e. kiegészítő ábra). Fontos, hogy az I332G Itgam knockin egerek jelentősen csökkent LLC tumor növekedést mutattak (1k ábra). Így míg a CD11b deléció serkenti a gyulladásgátló makrofág-polarizációt, gátolja a CD8+ T-sejtek rekrutációját és elősegíti a tumor növekedését, addig a CD11b aktiváció erőteljesen gátolja a tumor növekedését. Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy a makrofág CD11b kritikus funkcionális szerepet játszik a tumor növekedésének szabályozásában.

Immunszuppresszív jelek gátolják a CD11b expressziót

Hogy meghatározzuk, hogy a tumor mikrokörnyezetéhez kapcsolódó jelek megváltoztathatják-e a CD11b expressziót és ezt követően befolyásolhatják-e a myeloid sejtek polarizációját, megvizsgáltuk a makrofág közegek (mCSF-, IL-4- és IFNγ/LPS) hatását a sejtfelszíni CD11b expresszióra csontvelőből származó makrofágokban. Míg az IL-4 immunszuppresszív citokin csökkentette a CD11b expresszióját, addig az IFNγ/LPS pro-inflammatorikus ingerek fokozták a CD11b felszíni expresszióját az mCSF-stimulált makrofágokon kifejezett szintekhez képest (4a-b kiegészítő ábra). Emellett az immunszuppresszív faktor TGFβ, de nem az IL-10 gátolta a CD11b felszíni expresszióját (4c. kiegészítő ábra); a TGFβ, az IL-4 és a tumorsejtekkel kondicionált médium (TCM) szintén elnyomta a Cd11b mRNS expresszióját (4d. kiegészítő ábra). Fontos, hogy a TGFβ és a TCM csökkentette a CD11b sejtfelszíni expresszióját és serkentette az immunszuppresszív transzkripciót, miközben gátolta az immunstimuláló transzkripciót olyan módon, amelyet a TGFβR1 gátló SB525334 megfordított (4e-g. kiegészítő ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a tumor mikrokörnyezetében lévő citokinek, mint például a TGFβ, elnyomják a CD11b expresszióját vagy aktivációját, ezáltal elősegítve az immunszuppresszív makrofág-polarizációt.

A makrofág CD11b szabályozza az erek stabilitását

A makrofágok nemcsak az immunválaszt, hanem az angiogenezist és a desmoplasziát is szabályozzák azáltal, hogy olyan citokineket expresszálnak, mint a VEGF-A és a PDGF-BB, olyan növekedési faktorokat, amelyek az angiogenezis során az endotélsejteket, illetve az érrendszeri simaizmokat/pericitákat szabályozzák2. A daganatos erek gyakran egyetlen endotélrétegből állnak, amelyből hiányoznak a támogató periciták vagy simaizomsejtek; ezek az erek a daganatokban nagyobb számban fordulnak elő, mint a normál szövetekben, de rendellenesen alakulnak ki és rosszul perfundálnak. Ezzel szemben a magas PDGF-VEGF arányú daganatokban az ereket periciták, mezenchimális sejtek bélelik, amelyek stabilizálják az ereket és elősegítik a jobb tumorperfúziót23,24,25,26,27. Ezek a tumorok gyorsabban növekednek, mint az alacsonyabb PDGF/VEGF arányú tumorok, de a jobb tumorperfúziónak köszönhetően jobban reagálnak a kemoterápiára és az immunterápiára24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 . Mivel az Itgam-/- makrofágok magas PDGF és alacsony VEGF génexpressziót mutattak (1a, b ábra), megvizsgáltuk az erek fejlődésének mintázatát Itgam-/- és WT-tumorokban. A WT és Itgam-/- egerekből származó LLC és PyMT tumorok érrendszeri mintázatának értékelése azt mutatta, hogy az Itgam-/- tumorok kevesebb, hosszabb, szélesebb lumenű és kevesebb elágazási ponttal/mezővel rendelkező ereket mutattak, mint a WT tumorok (2a, b ábra; 5a. kiegészítő ábra). Az Itgam-/- tumorokban több olyan ér volt, amelyet Desmin+, NG2+ vagy SMA+ periciták/simaizomsejtek béleltek, mint a WT tumorokban (2a-c ábra; 5b. kiegészítő ábra). Ennek megfelelően ezek az erek kevésbé voltak permeábilisak az Itgam-/- egerekben, mint a WT egerekben, mivel kevesebb intravaszkuláris FITC-dextrán szivárgott a tumorparenchimába (2a-d ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az integrin CD11b szerepet játszik az érérés szabályozásában. Azt találtuk, hogy a PDGF-BB, de nem a VEGF-A génexpressziója erősen fokozódott a tumorokban (2e. ábra; 5c. kiegészítő ábra). Fontos, hogy a PDGF-BB fehérje expressziója is emelkedett az Itgam-/- tumorokban és a tumorból származó makrofágokban a WT tumorokhoz képest (2f. ábra). Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy a makrofág CD11b a tumor vaszkularizációját a PDGF megemelkedett szintjének konstitutív expresszióján keresztül szabályozza.

A CD11b neovaszkularizációban betöltött szerepére vonatkozó ezen megfigyelések alátámasztására azt találtuk, hogy az Itgam-/- egerek jól fejlett retinális érplexust mutattak (ábra. 2g, Isolectin B+, zöld) a születéskor (P1), szemben a WT egerekkel, amelyeknél a retina érhálózata fejletlen, de a posztnatális 1. naptól (P1) a P9-ig fokozatosan bővül. A felületes érplexus fejlettebb volt az Itgam-/- egerekben a P1 posztnatális naptól a P9 posztnatális napig, mint a WT újszülöttekben (2g. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a makrofágok és a CD11b kulcsszerepet játszanak a normális érrendszeri mintázódás szabályozásában.

Az Itgam-/- egerek fokozott éréréséért és daganatnövekedéséért az emelkedett PDGF-BB felelős-e, az LLC tumort hordozó WT és Itgam-/- egereket a PDGF-BB receptor PDGFR1 gátlójával, imatinabbal kezeltük. Az imatinib-kezelés elnyomta az Itgam-/- egerekben megfigyelt fokozott daganatnövekedést (2h, i ábra). Emellett növelte az érsűrűséget és elnyomta az érrendszer normalizálódását az Itgam-/- egerekben (2h, i. ábra). Ezek az eredmények együttesen alátámasztják azt az elképzelést, hogy az integrin CD11b a PDGF-BB expressziójának szabályozásán keresztül modulálja az érrendszer fejlődését.

A CD11b szabályozza a Let7a és a c-Myc expresszióját

A CD11b a transzkripciós faktorok, például a Stat3 aktiválásán keresztül szabályozhatja a gyulladásellenes makrofág-polarizációt, ami elősegítheti az immunszuppresszív és pro-angiogén faktorok, például az Argináz 1, Myc és VEGF37,38,39 expresszióját. Az Itgam-/- makrofágok konstitutívan foszforilált Stat3-at mutatnak (3a. ábra betét); a Stat3-inhibitor 5,15-DPP-vel történő kezeléssel az Itgam-/- makrofágokban az immunszuppresszív faktorok magas szintű expressziója a WT makrofágok szintjére csökkent (3a. ábra). Meglepő módon azonban a Stat3 gátlása nem befolyásolta az Itgam-/- makrofágokban megfigyelt magas szintű Il6-expressziót (3a. ábra). Fontos, hogy az IL-6 közvetlenül aktiválhatja a Stat338-at. Azt találtuk, hogy az IL-6 ugyanazt az immunszuppresszív polarizációs mintázatot segítette elő az egér és humán myeloid sejtekben és makrofágokban, mint amit az Itgam-/- makrofágokban megfigyeltünk (3b. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt sugallták, hogy az autokrin IL6 vezetheti az Itgam-/- makrofágokban megfigyelt konstitutívan immunszuppresszív polarizációt. Ezt az elképzelést alátámasztja, hogy az Il6 kiütése csökkentette a konstitutív Pdgfb expresszióját az Itgam-/- makrofágokban (3c. ábra). Mivel a TAM-ok az Il6-expresszió fő forrása a tumorokban15, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CD11b részben az Il6 myeloid sejtek általi átírásának szabályozásán keresztül az immunszuppresszió természetes fékeként szolgál.

A Let7 mikroRNS-család képes az Il6 expresszióját kontrollálni a tumor- és gyulladásos sejtekben40,41 . A mikroRNS-ek nem kódoló RNS-ek, amelyek az RNS-transzláció vagy -stabilitás befolyásolásával poszt-transzkripciós szinten módosítják a génexpressziót, és drámai hatással lehetnek a tumoros immunszuppresszióra és az angiogenezisre42,43. Azt találtuk, hogy a miRNS Let7a expressziója fordítottan korrelált az Il6 expressziójával egér és humán makrofágokban (6a-b kiegészítő ábra). Ezért megkérdeztük, hogy a CD11b expressziójának elvesztése a makrofágokban befolyásolja-e a Let7a expresszióját. Az Itgam-/- és Itgam siRNS-transzdukált makrofágokban és semlegesítő CD11b antitestek jelenlétében (3d. ábra; 6c. kiegészítő ábra) a Let7-et hasító és inaktiváló RNS-kötő fehérjétől, a Lin28-tól független módon csökkent a Let7 expressziója, mivel a Lin28 szintjét nem befolyásolta a CD11b expressziója vagy aktivációja (6b. kiegészítő ábra, d-e). A CD11b ICAM-1 általi ligálása elősegítette az időfüggő Let7a expressziót, miközben gátolta az Il6 expresszióját; fordítva, az adhézió elnyomása gátolta a Let7a expresszióját és elősegítette az Il6 expresszióját mind az egér, mind a humán makrofágokban (3e, f ábra). Fontos, hogy a Let7a miRNS (pre-miRNS) ektopikus expressziója gátolta az immunszuppresszív génexpressziót és serkentette a pro-inflammatorikus génexpressziót Itgam-/- makrofágokban, míg az anti-miRNS Let7a serkentette az immunszuppresszív génexpressziót és gátolta az immunstimuláló génexpressziót WT makrofágokban (3g. ábra). A CD11b ablációhoz hasonlóan (1a. ábra) az anti-miRNS Let7a serkentette a Pdgfb expresszióját, de nem volt hatással a Vegfa expressziójára (3h. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a CD11b aktiváció elősegíti a miRNS Let7a expresszióját, ami viszont gátolja az IL6 által közvetített immunszuppresszív makrofág gének expresszióját.

Az immunszuppresszív makrofág polarizációt szabályozó transzkripciós faktor, a c-Myc kötődik a Let7 promóteréhez és elnyomja annak transzkripcióját; érdekes módon a Let7 képes elnyomni a c-Myc expresszióját is44,45. Azt találtuk, hogy a c-Myc gén felszabályozott volt az Itgam-/- makrofágokban a WT makrofágokhoz képest (3i. ábra). A c-Myc fehérje expressziója és a szerin 62 foszforiláció, amely stabilizálja a transzkripciós faktort46 , szintén felszabályozott volt az Itgam-/- makrofágokban a WT makrofágokhoz képest (3j. ábra). Ezután megkérdeztük, hogy a cMyc funkció gátlása elősegítheti-e a Let7 expresszióját, és ezáltal megváltoztathatja-e a makrofágok polarizációját. Fontos, hogy a Let7a, Let7d és Let7f expressziója csökkent az Itgam-/- makrofágokban; azonban a c-Myc farmakológiai gátlása helyreállította a Let7 expresszióját az Itgam-/- makrofágokban, és megfordította az Itgam-/- makrofágok fokozott immunszuppresszív génexpresszióját (3k, l ábra). Ezek az adatok együttesen azt jelzik, hogy az integrin CD11b funkciója a Myc expresszió és az immunszuppresszív makrofág-polarizáció Let7-függő módon történő elnyomása.

Mivel a Let7a gátolja a makrofágok által közvetített Pdgfb expressziót, megvizsgáltuk a Let7a expresszió hatását a neovaszkularizációra in vitro és in vivo. Mikrohordozó gyöngyökhöz rögzített endotélsejteket és érrendszeri simaizomsejteket tenyésztettünk olyan fibringélben, amely vagy WT vagy Itgam-/- makrofágokat tartalmazott, amelyeket kontroll miRNS-szel, pre-miRNS Let7a, anti-miRNS Let7a vagy Pdgfb-bb siRNS-szel transzdukáltunk. Az Itgam-/- makrofágok serkentették a csírák megnyúlását, amit a makrofágok Let7a miRNS-szel vagy Pdgfb siRNS-szel történő transzdukciója gátolt (4a, b ábra; 6f. kiegészítő ábra). Ezzel szemben az anti-miRNS Let7a expressziója WT, de nem Itgam-/- makrofágokban serkentette a csírázás megnyúlását (4a, b ábra; 6f. kiegészítő ábra). Emellett az anti-miR Let7a-val transzdukált makrofágok in vivo serkentették az érett, pericitával bevont erek kialakulását bFGF-fel telített Matrigelben (4c. ábra). Ezek a vizsgálatok együttesen azt mutatják, hogy a CD11b a Let7a és az azt követő PDGF-BB expresszió szabályozásán keresztül szabályozza a neovaszkularizációt.

Myeloid sejtek Let7a szabályozza a tumor progresszióját

A Let7a szerepének vizsgálata a tumor immunszuppresszió és neovaszkularizáció szabályozásában, anti-miR Let7a-t juttattunk a tumorokba myeloid sejteket célzó nanorészecskékkel in vivo (ábra. 4d). Azt találtuk, hogy az integrin αvβ3 célzott nanorészecskéket a keringő myeloid sejtek specifikusan felvették a normál és tumoros állatokban (7a-h. kiegészítő ábra). Az anti-miRNS Let7a szállítása serkentette az LLC tumor növekedését, hasonlóan az Itgam-/- egerekben megfigyelthez (4d. ábra). Bár a Let7a kifejeződik a tumorok immun- és nem immunsejtjeiben, azt találtuk, hogy az anti-miRNS Let7a bejuttatása csak a Let7a kifejeződését gátolta a keringő monocitákban és a tumorhoz kapcsolódó makrofágokban, de más tumorhoz kapcsolódó sejtekben nem (4e. ábra). Fontos, hogy az anti-miRNS Let7a stimulálta az immunszuppresszív és pro-angiogén génexpressziót, és gátolta a pro-inflammatorikus génexpressziót a tumorokban a kontrollokhoz képest (4f. ábra, 8a. kiegészítő ábra). Az anti-miRNS Let7a az erek normalizálódását is serkentette a transzfektált tumorokban, mivel az erek hosszabbak, kevésbé elágazóak, erősen pericitákkal bevontak és kevésbé szivárgók voltak, mint a kontroll transzfektált tumorokból származó erek (4g, h ábra). Fontos, hogy az anti-Let7a elnyomta a CD8+ T-sejtek toborzását a tumorokba és fokozta a CD4+ T-sejtek toborzását a tumorokba (4i. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a CD11b a miRNS Let7a szabályozásán keresztül visszafogja az immunszupressziót és az érrendszeri érést. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a tumorok fokozott érrendszeri normalizálódása javíthatja a tumor perfúzióját és elősegítheti a terápiára való érzékenységet23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Annak megállapítására, hogy az anti-miRNS Let7a által kiváltott érrendszeri normalizáció fokozhatja-e a kemoterápia hatékonyságát a tumorperfúzió növelése révén, LLC tumort hordozó egereket kezeltünk anti-miRNS Let7a vagy kontroll miRNS célzott bejuttatásával kemoterápiával (gemcitabin) kombinálva (4j. ábra). Míg az anti-miRNS Let7a elősegítette az LLC tumor növekedését, addig a gemcitabinnal kombinált anti-miRNS Let7a jelentősen csökkentette a tumor növekedését, ami összhangban van azzal az elképzeléssel, hogy a Let7a gátlása növeli a tumor hozzáférhetőségét a kemoterápia számára (4k. ábra). Ezekkel az eredményekkel összhangban azt találtuk, hogy az Itgam-/- egerek gemcitabin kezelése mélyebben elnyomta a tumor növekedését, mint a WT egerek gemcitabin kezelése (8b. kiegészítő ábra). Mivel az Itgam-/- egerek nagyobb perfúziót mutattak (kevesebb érszivárgás), mint a WT egerek (8c. kiegészítő ábra), ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy a CD11b a miRNS Let7a-ra gyakorolt hatásán keresztül kritikus szerepet játszik a tumor immun- és érválaszának szabályozásában.

A CD11b agonista LA1 gátolja a tumor növekedését

Eredményeink azt sugallták, hogy a CD11b célzott farmakológiai aktiválása in vivo repolarizálhatja a tumorhoz kapcsolódó makrofágokat, ami a tumor immunszuppressziójának és a tumor növekedésének gátlásával jár. Ezért megvizsgáltuk a CD11b egy kismolekulás agonistájának, a leukadherin 1 (LA1)47,48 (5a. ábra) hatását a makrofágok polarizációjára és a tumor növekedésére. Az LA1 serkentette a myeloid sejtek adhézióját az ICAM-1 bevonatú szubsztrátumokhoz olyan módon, amelyet anti-CD11b-neutralizáló antitestek gátoltak (5b. ábra). Az LA1 serkentette a makrofág immunválasz génexpressziót, amit az Il1b, Tnfa, Il12, Nos2 és Ifng mRNS-ek expressziójának növekedése mutatott (9a. kiegészítő ábra). Mivel az LA1 serkentette a Let7a expresszióját és gátolta a Pdgfb és az Il6 expresszióját (5c. ábra), ezek az eredmények azt sugallták, hogy az LA1 serkentheti a pro-inflammatorikus immunválaszt, amely in vivo gátolhatja a tumor növekedését. Az LA1 tumorasszociált makrofágokra gyakorolt in vivo hatásának felmérése érdekében tumorasszociált makrofágokat izoláltunk10 , előtte LA1-gyel kezeltük, majd LLC tumorsejtekkel együtt ültettük be őket. Az LA1-gyel kezelt makrofágok teljesen gátolták a tumor növekedését (5d, e ábra), annak ellenére, hogy az LA1-nek nem volt közvetlen hatása az LLC vagy a makrofágok életképességére (5e, f ábra). Bár az LA1-nek nem volt hatása a CL66-Luc emlőtumorsejtek növekedésére in vitro (9b. kiegészítő ábra), az LA1 hatásosabban csökkentette a tumor növekedését szinogén, ortotópikusan beültetett CL66-Luc emlőtumorokban, mint a taxol (5g. ábra). Az LA1 a CL66-Luc emlőtumorok növekedésének elnyomása érdekében a besugárzással együtt is szinergikusan hatott (5h. ábra), és elnyomta az ortotópos, humán MDA-MB-231 emlő xenograft tumorok növekedését (5i. ábra). Fontos, hogy az LA1 gátolta az LLC egér-tüdőtumor növekedését WT, de nem Itgam-/- egerekben, ami azt jelzi, hogy az LA1 az integrin CD11b-n keresztül hat a tumorok növekedésének elnyomására (5j, k ábra).

Mivel az LA1-kezelés növelte a jellemzően immunkompetensnek tartott MHC-II+ makrofágok jelenlétét, és csökkentette a jellemzően immunszupresszívnek tartott CD206+ makrofágok jelenlétét az LLC és CL66-Luc tumorokban (9c-d. kiegészítő ábra), vizsgálataink arra utalnak, hogy az LA1 repolarizálja a tumorhoz kapcsolódó makrofágokat. Ennek megfelelően azt találtuk, hogy az LA1 gátolta az S100A8 és az MMP9 expresszióját a CD11b+ sejtekben az LLC tumorokban, valamint gátolta az Argináz1, az S100A8 és az MMP9 expresszióját a CL66-Luc tumorokban (9e-f. kiegészítő ábra). Mivel ezek a fehérjék a pro-tumorális makrofágok markerei, ezek a vizsgálatok együttesen azt jelzik, hogy az LA1 valószínűleg a tumorhoz kapcsolódó makrofágok repolarizációja révén gátolja a tumor növekedését. Az LA1-kezelés valóban növelte a CD8+ T-sejtek jelenlétét mind az LLC, mind a CL66-Luc tumorokban (10a-c. kiegészítő ábra). Azt is megfigyeltük, hogy az LA1-kezelés megváltoztatta a tumorok neovaszkularizációját az SMA + erek számának csökkenésével (5l. ábra). A tumorok pro-inflammatorikus immunprofiljának fokozásával és a tumorok érrendszeri normalizációjának gátlásával a kis molekulájú CD11b agonista LA1 jelentősen megváltoztatta a makrofágok polarizációját, növelte a CD8+ T-sejtek toborzását a tumorokba és gátolta a tumor progresszióját egér és humán rák egérmodelljeiben.