Miután 1853-ban a Sorbonne-on orvosi diplomát szerzett az ízületi reuma különböző formáiról szóló doktori disszertációjával, Charcot először egy magánpraxis tulajdonosaként, majd 1848-tól kórházi orvosként dolgozott a Salpêtrière-ben, ahol 1862-ben főorvos lett. 1872-ben a párizsi egyetem patológiai anatómia professzora lett, ahol számos művet publikált az idegrendszer anatómiájáról és patológiájáról. 1882-ben a párizsi Hôpital de la Salpêtrière-ben Charcot számára létrehozták a világ első idegrendszeri betegségekkel foglalkozó tanszékét.
1883-ban Charcot-ot felvették az Académie des sciences tagjai közé. 1888 és 1889 között publikálta híres Leçons du mardi című művét, amelyben klinikai eseteket mutatott be orvosokból, újságírókból és írókból álló nemzetközi közönség előtt.
A 19. század egyetlen más tudósnak sem volt olyan maradandó hatása a neurológia fejlődésére, mint Charcot-nak. A 19. század 2. felében a neurológia szinte minden területén fontos felfedezéseket tett. Ő írta le elsőként az amyotrófiás laterálszklerózist és a neurogén arthropátiát. A szklerózis multiplexet és a Parkinson-kórt mint önálló kórképeket is megkülönböztette egymástól.
1884. június 7-én Charcot asszisztensének, Raymond Combret-nek, a párizsi Teozófiai Társulat tagjának közvetítésével találkozóra került sor Henry Steel Olcott-tal, a Teozófiai Társulat tagjával a Salpêtrière-ben. Későbbi éveiben Charcot elsősorban pszichopatológiai tanulmányokat folytatott a hisztériáról. Bár néhány megállapítását később felülvizsgálták, azok nagy hatással voltak a pszichiátria fejlődésére és tanítványa, Sigmund Freud pszichoanalízisére. Charcot a hipnózis klinikai alkalmazása a hisztéria organikus okának megtalálására tett kísérletében váltotta ki Freud érdeklődését a neurózisok pszichológiai okai iránt.
Freud 1885 augusztusától tanult Charcot-nál a Salpêtrière-ben. Bár később sikeresen megalapozta alkotását, a pszichoanalízist, mint önálló tudományt, gyakran elfelejtik, hogy az Charcot hipnózistanulmányával kezdődött. Charcot egyéb, a hipnotikus transz okozta megváltozott tudatállapotokkal kapcsolatos kutatásai más tudományágakhoz vezettek, amelyek kevésbé voltak összhangban a materialista korszellemmel, mint Freudé. Freud lefordította Charcot két könyvét, és kritikai megjegyzésekkel látta el őket.
Charcot a 19. század uralkodó tudományát képviselte, amely megbékélt a hipnózissal, és az általa megfigyelt tünetekre neurofiziológiai magyarázatot keresett. Olyan tisztán materialista magyarázatot keresett, amely alapján a könnyen hipnotizálható személyek mentálisan betegnek tekinthetők, és amely alapján a hipnózis egymást követő szakaszai szigorúan osztályozhatók. Hipotéziseit csak 1884-ben kérdőjelezte meg Hippolyte Bernheim és Ambroise-Auguste Liébeault, akik elmélete szerint a hipnotikus állapotot szuggesztió hozza létre, amit végül Liébeault orvosi gyakorlatában be is bizonyított. Kiderült, hogy Charcot meggyőződése, miszerint a hipnózisnak kóros okai vannak, abból a tényből eredt, hogy a Salpêtrière-ben túlnyomórészt hisztérikusokkal dolgozott. Charcot néhány hónappal halála előtt beismerte vereségét, amikor egy cikkében kijelentette, hogy a hisztériások elvileg könnyen alávethetők a szuggesztiónak.
Charcot 1893 után halt meg angina pectoris rohamban.
Jean-Martin Charcot, mint fiatal kora óta művészileg tehetséges és a művészet iránt érdeklődő orvos, összegyűjtötte a hisztéria történelmi ábrázolásait. A fényképezést egyrészt a klinikai dokumentáció módszereként, másrészt a tanítás didaktikai módszereként (diavetítés) is bevezette.
Charcot munkáit Axel Munthe részletesen ismerteti A San Michele könyvében. Charcot-ról részletesen beszámol Henri F. Ellenberger A tudattalan felfedezése: A dinamikus pszichiátria története és fejlődése a kezdetektől Janetig, Freudig, Adlerig és Jungig című standard művében.
Charcot további híres tanítványai voltak Georges Gilles de la Tourette, Joseph Babinski, Gheorghe Marinescu, Pierre Janet és Charles-Joseph Bouchard.