A kiméra egy lény volt a görög mitológiában, amelyet általában egy oroszlán, egy kecske és egy kígyó összetételével ábrázoltak. A “kiméra” kifejezés kortárs használata a vérképzősejt-transzplantációban ebből a “kevert” entitás gondolatából ered, utalva arra, aki genetikailag különböző szövetekből kapott transzplantációt. A hematopoetikus őssejt-transzplantációt követő kimérializmus vizsgálata magában foglalja a recipiens és a donor genetikai profiljának azonosítását, majd a keveredés mértékének értékelését a recipiens vérében, csontvelőjében vagy más szövetében.
A DNS-alapú kimérializmus-vizsgálat (beültetés-elemzés) a humán identitásvizsgálatban általánosan használt módszert alkalmazza, és a rövid tandemismétlődésű (STR) lokuszoknak nevezett genomiális polimorfizmusok elemzésével valósul meg. Ezek a lókuszok egy olyan DNS magszekvenciából állnak, amely változó számú alkalommal ismétlődik egy különálló genetikai lókuszon belül. Az STR, más néven mikroszatellit kifejezés a tandemszerűen ismétlődő DNS magszekvencia bázispárjainak számára utal, amelynek hossza 2-8 bázispár között mozog. Ezek a lókuszok olyan allélokat mutatnak, amelyek hossza egyénenként eltérő lehet, és kodomináns mendeli tulajdonságként öröklődnek. Az STR-lókuszokat az egész emberi genomban azonosították, és egyes lókuszok több mint 25 alléllal rendelkeznek.
A lókuszok konzervált kísérő régióiban található DNS-szekvenciainformációkat az STR-ek oligonukleotid-primerpárjainak létrehozásához használják. Ezeket a primereket a vizsgálati minták PCR (polimeráz láncreakció) amplifikációjában használják. Ez a technika akár egymilliárdszor is képes felerősíteni az STR-szekvenciát, és olyan anyagot szolgáltat, amely elektroforetikus géllel vagy kapilláris elektroforézissel (CE) szétválasztható. A genotipizálás a DNS-fragmentumok méretének kiértékelésével történik. Az STR-allélek pontos azonosításához alléllétrára való hivatkozás használható.
A PCR-alapú STR/CE-rendszer számos előnnyel rendelkezik más vizsgálati módszerekkel szemben. Több STR-lokusz amplifikációja kombinálható (multiplexelhető) egyetlen csőben, ami lehetővé teszi akár tizenhat lokusz elemzését egy reakcióban. Mivel parányi mennyiségű DNS-re van szükség, alacsony sejtszámú minták is felhasználhatók, és az STR-allélek kis mérete még a lebomlott DNS-minták felhasználását is lehetővé teszi. A digitális adatok megkönnyítik az elemzést és az archiválást, a CE-eljárás pedig gyors és költséghatékony. Az STR-lókuszok PCR-amplifikációja és elemzése gyors és megbízható módszert biztosít az őssejt-transzplantációs környezetben az átültetés állapotának értékelésére.
A jelenleg alkalmazott technológia lehetővé teszi tizenhat lokusz együttes amplifikációját és három színnel történő kimutatását, amelyek három 5 vagy 6 lokuszból álló csoportra vannak felosztva, amelyek nem átfedő mérettartományú amplifikált fragmentumokat mutatnak.
A PCR-amplifikációs lépés során az amplifikált fragmentumokat fluoreszcens festékekkel jelöljük. A PCR-amplifikációt követően a mintákat kapilláris elektroforézis (CE) rendszeren dolgozzák fel.
Az adatok elemzését megkönnyíti egy fragmentumelemző szoftver, amely a DNS-fragmentumokat a mintával együtt lefuttatott belső sávstandard segítségével méretezi, és a CE-futtatásban szereplő STR alléllétrával való összehasonlítással rendeli hozzá a genotípusokat. Ezáltal a donor és a transzplantált recipiens számára különálló STR genotípusos profilokat kapunk. Az ezen egyének között polimorf (azaz informatív) STR-lokuszokat a recipiens és donor DNS relatív mennyiségének értékelésére használják a transzplantáció utáni mintában.
A vizsgált minták bármilyen DNS-t tartalmazó anyagból származhatnak, beleértve a csontvelőt, perifériás vért, szolid tumorokat, epidermális szövetet, hajhagymákat, bukkális tamponokat és frakcionált sejtalcsoportokat. Mivel a minta PCR-amplifikációja rutinszerűen kevesebb mint 2 ng genomiális DNS-sel történik (ami körülbelül 300 sejtnek felel meg), a kimérialitás vizsgálata ezzel a módszerrel sikeresen elvégezhető még a transzplantációs kudarcban, súlyos leukopéniában szenvedő betegeknél vagy vérképző sejtek alcsoportjainak frakcióiból is. Az STR-analízist használták a vérképzősejt-transzplantáción átesett betegek átültetési státuszának értékelésére, beleértve a kettős köldökzsinórvér-donor egységet vagy más donortól származó második transzplantációt kapott betegeket is; valamint a feltételezett egypetéjű ikrek genetikai azonosságának megerősítésére, és a méhen belüli anyai sejtbeültetés kimutatására a súlyos kombinált immunhiány (SCID) diagnózisával rendelkező betegeknél. Az STR/CE analízis gyors, megbízható, pontos és reprodukálható eljárás.
A vizsgálat korlátai
- A vizsgálati mintákból elegendő DNS-t kell izolálni a robusztus PCR-amplifikációhoz. A DNS-izolálási módszereknek rendelkezésre kell állniuk az alacsony sejtszámú minták kezeléséhez, mint amilyenekkel a transzplantációs elégtelenségben szenvedő recipienseknél és az áramlási citometriás vonal-specifikusan szortírozott fehérvérsejt-alcsoportokból találkozhatunk. A minták koncentrációja túl alacsony lehet ahhoz, hogy UV spektrofotometriás OD260 méréssel számszerűsíteni lehessen. Az 5 000-30 000 izolált sejtből származó DNS-minták megbízhatóan elfogadható amplifikációt biztosítanak. A laboratórium rendelkezik iránymutatásokkal, amelyek meghatározzák, hogy mikor kell megismételni a mintaelemzést.
- A kereskedelmi készletekkel számos STR-loci rendelkezik informatív alléllal mind a donor, mind a recipiens számára a nem rokon donorok esetében. A rokon donor transzplantációs párok esetében azonban az informatív STR-lókuszok száma akár 3-ra is korlátozódhat. A mindössze 3 STR-loci átlagát reprezentáló mennyiségi értékek reprodukálhatóknak bizonyultak.
- A rosszindulatú betegségben szenvedő betegeknél előfordulhatnak olyan klonális mutációk, amelyek hatással vannak bizonyos STR-locira. A beteg allélja hiányozhat egy vagy több STR-lociban, ha összehasonlítjuk a beteg transzplantáció előtti mintájában azonosított allélokat a transzplantáció utáni mintával. Ritkán előfordulhat, hogy egy adott lokuszon olyan extra beteg STR-allélt mutatnak ki, amely a transzplantáció előtti mintában nem volt jelen. A legtöbb esetben ezek az anomáliák valószínűleg kromoszómatranszlokációknak tudhatók be. A hiányzó allélok mutáció eredménye is lehet az STR konzervált flankáló szekvenciáin belül, ahol a PCR-primerek találhatók. A hiányzó vagy extra alléllal rendelkező STR-lokuszok adatait nem használjuk fel a mennyiségi meghatározáshoz.
- Ha a beteg transzplantáció előtti sejtjei nem állnak rendelkezésre, a transzplantáció után olyan mintákat lehet gyűjteni, mint a bukkális tampon, bőrbiopszia vagy hajhagymák. Meg kell azonban jegyezni, hogy a bukkális minták jelentős mennyiségű donorsejtet tartalmazhatnak.
- A vizsgálat nem a minimális maradékbetegség kimutatására szolgál.
Klinikai indikációk a kimerizmus vizsgálatára vérképzősejt-transzplantációban
A perifériás vérben és/vagy csontvelőben lévő fehérvérsejtek donor/felvevő eredetének rutinszerű transzplantáció utáni dokumentálása. Az átültetés dokumentálása magában foglalhatja a vonal-specifikus sejtalcsoportok, például a CD3 pozitív T-sejtek és a CD33 pozitív myeloid sejtek vizsgálatát.
A donor/befogadó sejtek értékelése elégtelen csontvelőfunkciójú betegeknél.
Határozza meg, hogy a recidív vagy új malignitás a recipiens vagy a donor sejtjeiből származik-e.
A kilökődés és a recidív malignitás prognosztikai kockázatainak értékelése.
Dokumentálja a donor sejtek perzisztenciáját a transzplantáció után recidív betegségben szenvedő betegeknél vagy a donor limfocita infúzió (DLI) előtt.
Vizsgálja meg, hogy a második transzplantációra jelölt recipienseknél történt-e graftkilökődés.
Differenciálja a donorsejtek eredetét azoknál a recipienseknél, akik más donorral vagy kettős köldökzsinórvér-egységgel végzett második transzplantációban részesültek.
Az anyai eredetű sejtek jelenlétének kimutatása súlyos kombinált immunhiánnyal (SCID) diagnosztizált betegeknél.
A feltételezett egypetéjű ikrek genetikai azonosságának ellenőrzése.
Gyakran ismételt kérdések
Kérdés: Válasz: Hogyan történik a többszörös donorok elemzése?
Válasz: Hogyan történik a többszörös donorok elemzése?
Kérdés:
Válasz: Miért vizsgálják az anyai átültetést?
Válasz: Miért vizsgálják az anyai átültetést? A súlyos kombinált immunhiánnyal (SCID) diagnosztizált betegek anyai eredetű vérképzőszervi sejteket kaphattak a méhen belül. Bizonyos vonal-specifikus sejtalcsoportok (különösen a CD3-pozitív sejtek) túlnyomórészt vagy teljesen anyai eredetűek lehetnek.
Kérdés:
Válasz: Mi a különbség a “teljes” és a “vegyes” kimérizmus között?
Válasz: Mi a különbség a “teljes” és a “vegyes” kimérizmus között?
A “teljes” kimérizmus olyan betegre utal, akinél a transzplantáció után a vérképző sejtek fenotípusa teljes egészében donor eredetű.
A “vegyes” kimérizmus olyan betegre utal, akinél a transzplantáció után a vérképző sejtekben a beteg és a donor fenotípus keveréke jelenik meg.
Kérdés:
Válasz: Mi történik, ha nem áll rendelkezésre recipiens alapminta?
Válasz: Mi történik, ha a recipiens alapminta nem áll rendelkezésre? A transzplantáció utáni recipiens minta megszerzésére több lehetőség is rendelkezésre áll: bukkális törlőkendő, hajgyökér- vagy bőrbiopsziás minta használható recipiens alapmintaként. A bukkális törlőkendőmintákat óvatosan kell használni, mivel a bukkális mintákban jelentős mennyiségben lehetnek jelen donorsejtek.
Kérdés:
Válasz: Mi a teendő, ha nem áll rendelkezésre donor alapminta?
Válasz: Ha a donor él, szerezzen új vérmintát. Ha a donor nem él, a transzplantáció utáni mintákat össze kell hasonlítani a beteg transzplantáció előtti alapmintáival, hogy azonosítani lehessen a kimutatott, de nem beteg eredetű STR allélokat.
Kérdés:
Válasz: Miért nem használható a HLA az átültetés ellenőrzésére?
Válasz: Miért nem használható a HLA az átültetés ellenőrzésére? A transzplantációs donorokat úgy választják ki, hogy a lehető legjobban illeszkedjenek a recipienshez. Nincsenek HLA markerek, amelyek megkülönböztetik a recipienst és a donort, ha egyeznek, és csak egy vagy kettő, ha nem egyeznek. Ráadásul más technológiák gyakran érzékenyebbek erre a célra, mint a HLA nem egyező allélok ellenőrzése; következésképpen más lókuszokat használnak az egyedi profilok biztosításához.
Kérdés:
Válasz: Mi az informatív STR-lókusz?
Válasz: Mi az informatív STR-lókusz? Ez egy olyan lókusz, amely legalább egy, a recipiensre vagy a donorra jellemző alléllal rendelkezik. Ahhoz, hogy egy lókusz hasznos legyen a kimérizmusszámításokhoz, mindkettőnél egyedi alléllal kell rendelkeznie. Nagyszámú informatív lókusz lehet, ha nem rokon donort használnak a transzplantációhoz, de nagyon kevés, ha egyező testvért használnak. Az egyes lókuszok alléljainak amplifikációs hatékonysága közötti különbségek miatt a pontosság növelése érdekében célszerű több lókuszból átlag- vagy mediánértékeket kapni. Az egyes lókuszokból származó eredmények megbízhatóan reprodukálhatók, így akár egyetlen lókusz is használható egymást követő minták tendenciájának meghatározására.
Kérdés:
Válasz: Mi az az “amelogenin” lókusz, amelyet egyes amplifikációs panelek tartalmaznak?
Válasz: Mi az az “amelogenin” lókusz, amelyet egyes amplifikációs panelek tartalmaznak? Az amelogenin gén az X és Y kromoszómákon található. Nem STR, hanem különböző méretű termékeket mutat az adott kromoszómákon. Ez teszi hasznossá a nemek meghatározására. A törvényszéki közösséget megcélzó kereskedelmi készletgyártók, ahol az X/Y megkülönböztetést széles körben használják, a primerpanelben szerepel. Általában nem használják kimerizmuselemzésre, mivel nem tud egyedi női markert biztosítani (egy férfi minta mindig tartalmaz egy X allélt); és nem hasznos a nemhez illeszkedő őssejt-transzplantációt követő minták értékelésénél sem.
Kérdés:
Válasz: Miben különbözik az STR-kimerizmus analízis a genotipizálástól?
Válasz: Az STR-kimerizmus analízis a genotipizálástól: A “genotípus” egy adott lókuszban jelenlévő meghatározott allélokra utal. A genotipizálást a recipiens és donor profilok megállapítására végzik a kimérizmusvizsgálat során. Amikor egy őssejt-transzplantációt követően kiméraanalízist végeznek, a recipiens és a donor genotípusos profilját összehasonlítják a transzplantáció utáni minta profiljával annak értékelésére, hogy az egyes komponensekből mennyi van jelen.
A genotipizálást más esetekben is használják, például törvényszéki vizsgálatoknál és származásvizsgálatoknál. A törvényszéki elemzők a genotípusokat arra használják, hogy bűnügyekben azonosítsák a bizonyítékok forrását, és kizárják az embereket a gyanúsítottak köréből. Az emberi maradványokat “John Doe” ügyekben és tömeges katasztrófák esetén is azonosítani tudják. A szülői származás meghatározását hasonló módon végzik, hogy kizárjanak valakit mint lehetséges szülőt azáltal, hogy olyan allélokat találnak a gyermekben, amelyek nem egyeznek sem az anyával, sem a feltételezett apával.
Irodalmi hivatkozások/ajánlott olvasmányok
Bryant E, Martin PJ. Az átültetés dokumentálása és a kimérialitás jellemzése vérképzősejt-transzplantációt követően. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, szerk. Hematopoietikus sejtek transzplantációja. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.