Kloridion-csatornák és transzporterek: a természet érdekességeitől és az emberi betegségek forrásától a gyógyszercélpontokig

Ez gyakorlatilag minden esetet kielégít a tanteremtől a kutatólaborig, amíg a kloridcsatornákra nem tekintünk. Tudjuk, hogy léteznek, fontosak és jó gyógyszercélpontok lehetnek számos betegségben, de egészen a közelmúltig kissé megbélyegzettek és divatjamúltak maradtak a terápiák világában. A szelektív ligandumok hiánya egyáltalán nem segített ezen. Az egyetlen kivétel ez alól a GABA-A receptor volt, amely egy intrinsic kloridcsatornához kapcsolódik, amely a GABA gátló neurotranszmitter kötődésére megnyílik. A benzodiazepinek a Valium 1960-as évekbeli megjelenése óta potencírozzák ezt a receptort, szedatív és görcsoldó hatást biztosítva. Ez egy fontos fogalmat vezet be: több géncsalád és különböző fehérjetípus létezik, amelyeket kloridcsatornaként írhatunk le.

Ez ellentétben áll azzal, amit a kationszelektív ioncsatornákról tudunk, ahol a fehérjeszerkezetben kevés rugalmasság van, amely kálium-, nátrium- vagy kalciumszelektív pórust képezhet; ezen ioncsatornák sokféleségét a pórustól különböző fehérjetartományok variációi hozzák létre, amelyek befolyásolják a nyitási-zárási viselkedést. Az igazsághoz tartozik, hogy úgy tűnik, nem sok fiziológiai oka van annak, hogy egy anioncsatornának klorid-szelektivitást kellene mutatnia, mivel más halogenidek vagy kis anionok membrántranszportjában kevés fiziológiai szerepe van; bármely anioncsatorna fiziológiai szempontból alapértelmezetten kloridcsatorna lesz. Másrészt a kálium-, nátrium- és kalcium-membránáramok mindegyike más-más alapvető szerepet játszik, és az e kationok iránti szelektív membránpermeabilitás kulcsfontosságú a sejtműködés, sőt maga az élet szempontjából.

A GABA-A receptorok a cys-hurok pentamer ligandumkapcsolt ioncsatorna-családok tagjai, amelyek többféle gerjesztő és gátló neurotranszmitterkapcsolt csatornát tartalmaznak. A cisztás fibrózis transzmembrán szabályozó (CFTR) fehérje egy nukleotid-szabályozott kloridcsatorna. A változatos ATP-kötő kazettás (ABC) transzporter család tagja, és az egyetlen, amely a jelek szerint nem szállít semmilyen szubsztrátot a membránon keresztül, hanem kloridcsatornaként működik. A CLC-család feszültségkapcsolt kloridcsatornái egy másik különálló géncsaládból származnak, és általános szerkezetük egyedülálló a membránfehérjék között. Ez a fehérjecsalád számos meglepetést okozott az elmúlt 30 évben, és e család tagjai itt kerülnek bemutatásra, valamint az is, hogy miként jöhetnek szóba gyógyszercélpontként.

A kloridcsatornák területéről további izgalmas fejlemények jelentek meg a kalcium-aktivált kloridcsatornák (ClCa) alapjául szolgáló fehérjék molekuláris azonosítását követően. Funkcionálisan már jó ideje ismerjük élettani szerepüket, de a csatornafehérjék közelmúltbeli molekuláris azonosítása lehetővé tette molekuláris és farmakológiai eszközök kifejlesztését aktivitásuk vizsgálatára és megváltoztatására. Ez az áttekintés a ClCa csatornák és a CLC-fehérjék célzott kezelésének farmakológiai lehetőségeire összpontosít; működésüket és szubcelluláris lokalizációjukat az 1. ábra foglalja össze.

Egy bevezetés a CLC-fehérjékbe

A fehérjecsalád kilenc tagja a CLC-1-7, CLC-KA és KB. Az alapító tag, a CLC-1 a vázizomzat feszültségkapcsolt kloridcsatornája, amelyet az alábbiakban tárgyalunk. Számos funkcionális vizsgálatot végeztek a CLC-0 tiszteletbeli címet viselő homológon, amelyet az Electroplax elektromos szervből izoláltak, amely lehetővé teszi a ráják számára, hogy elkábítsák vízi áldozataikat. A CLC-0 lipid kettősrétegekbe történő rekonstitúciója és az egyes ioncsatornákon átfolyó áramok elektrofiziológiai rögzítése egy érdekes tulajdonságot tárt fel. Általában, amikor egyetlen ioncsatornát tartalmazó kis membránfolton áramot rögzítünk, két áramamplitúdó közötti ingadozást figyelhetünk meg: az egyik a zárt csatornát, a másik a nyitott csatornán átfolyó áramot képviseli. Az ingadozások a nyitott és zárt kinetikai állapotok közötti átmeneteket tükrözik. A CLC-0 esetében azonban nyilvánvalóvá vált, hogy az egyetlen ioncsatorna-fehérje két egyenértékű pórusból áll, amelyek egymástól függetlenül kinyílhatnak1. Ezt a csatornát ezért kétsorosnak írták le (2. ábra). Így nem okozott nagy meglepetést, hogy az enterális baktériumokból származó homológok kristályszerkezeteiből kiderült, hogy a fehérjekomplex egy dimer, amelyben mindkét alegység rendelkezik egy-egy ionvezető úttal2 (2. ábra).

A második meglepetés akkor ért, amikor részletes funkcionális kísérleteket végeztek az E. coliból származó CLC-ec1-en. Ahelyett, hogy kloridcsatornaként működne, mint rég elveszett rokona a gerincesek vázizomzatában, a CLC-ec1 egy 2Cl-/H+ csere transzporter, vagy antiporter, szigorú 2:1 csere sztöchiometriával3. Ez a fehérje fontos az enterális baktériumok túléléséhez alacsony pH-n4 , és valószínűleg kihasználja a kloridgradienst, hogy a sejtek pH-ját elviselhető szinten tartsa. A prokarióta CLC-k ezért a patogén E. coli- vagy Salmonella-fertőzés kezelésére szolgáló inhibitorok célpontjai lehetnek4. Az ioncserélő viselkedés felfedezése természetesen további erőfeszítéseket serkentett annak megállapítására, hogy létezik-e ilyen klorid-proton csere az emlős CLC-kben, abból a feltételezésből kiindulva, hogy a Cl-/H+ csere lehet az archetipikus CLC-k valódi funkciója, és a kloridcsatornaként azonosított csatornák talán csak kivételek a szabály alól. Úgy tűnik, ez a helyzet, mivel erős bizonyíték van arra, hogy a CLC-3-tól a CLC-7-ig 2Cl-/H+ -cserélő transzporterekként működnek, elsősorban intracelluláris organellumokban, míg a CLC-1, CLC-2, KA és KB valódi plazmamembrán kloridot vezető ioncsatornák5-9. Mivel a CLC-k archetipikus tulajdonsága a cseretranszport, amely a sejtes élet minden formájában megtalálható, a fehérjék utóbbi alosztálya, a jóhiszemű kloridcsatornák ezért “megszakított” kloridtranszportereknek tekinthetők, amelyek elvesztették a kloridszállításnak egy második szubsztrátion mozgásához való kapcsolódását.

CLC-1

A CLC-család ezen alapító tagja a vázizomzat feszültségkapcsolt kloridcsatornája, amely a membránpotenciál szabályozására és a membrán akciós potenciálokat követő repolarizációjára szolgál az izom ellazítása érdekében. A legtöbb szövetben azt várnánk, hogy a káliumcsatornák játsszák ezt a szerepet, amit a szív- és a simaizomban, valamint a membránok gerjeszthetőségének szabályozásában más sejttípusokban is megtesznek. A transzverzális tubulusrendszer a plazmamembrán (szarkolemma) meghosszabbítása, és behatol a kontraktilis szövetbe. Kritikus fontosságú az elektromos aktivitás gyors terjedése szempontjából az izomban, és a gyors és ellenőrzött összehúzódást hangszereli. A kálium kiáramlása az izomsejtekből a t-tubulus zárt terébe megemelné az extracelluláris káliumkoncentrációt és összeomlasztaná ezt az iongradienst, ami elhúzódó membrándepolarizációhoz vezetne. Mivel a kloridcsatornák játsszák a domináns repolarizáló szerepet, ez megakadályozható. A CLC-1 funkcióvesztéses mutációi emberben, kecskében és egerekben myotóniához vezetnek (a közelmúltban készült áttekintést lásd10), és az izomrelaxáció károsodása jellemzi, ami összhangban van a repolarizáló membránáram elvesztésével.

A vázizomzatra korlátozódó expresszióval a CLC-1 vonzó célpontja lehet olyan gyógyszereknek, amelyek a CLC-1 funkciójának növelésével vagy csökkentésével szabályozzák az izomösszehúzódást, és ezáltal csökkentik, illetve növelik az izomgerjedelmet. A CLC-1 funkciót növelő vegyületek alkalmasak lehetnek a myotonia kezelésére, különösen azokban az esetekben, amikor kompenzálni tudják a kloridcsatorna-aktivitás részleges elvesztését. A CLC-1 gátlása csökkentheti az izomösszehúzódás küszöbét, és hasznos lehet izomgyengeség vagy degeneratív betegségek, például izomdisztrófia esetén.

CLC-2

A befelé korrigáló kloridcsatorna, a CLC-2 némileg széles szöveti eloszlással rendelkezik. Megtalálható a központi neuronokban, ahol szabályozza a neuronális aktivitást11-13. Az asztrocitákban a sejtkötésekhez való szubcelluláris célzását a GlialCAM-mal (MLC1) való kölcsönhatás szabályozza, amelynek mutációi megzavarják ezt a célzást, és megalencephalicus leukoencephalopathiát okoznak14. A legújabb terápiás érdeklődés a CLC-2 expresszióját érinti a bélnyálkahártyában és a tüdő bronchiolákban, ahol szerepet játszik a bél-, illetve a tüdőszekrécióban. A klinikailag a székrekedés enyhítésére használt lubiprostonról azt feltételezték, hogy hatását a CLC-2 aktiválásával fejti ki, de ez a hatás vitatott. Míg egyes vizsgálatok szerint ez a vegyület aktiválja a CLC-2 csatornákat, más vizsgálatok szerint szabályozza a CLC-2 forgalmát és a prosztaglandinreceptor aktiválásán keresztül növeli a CFTR működését15,16. Ugyanakkor továbbra is elegendő bizonyíték van arra, hogy a légúti CLC-2 funkciójának növelése alternatív kloridútvonalat biztosíthat a cisztás fibrózisban17.

CLC-KA/KB

Ezek a kloridcsatornák különösen a vese epithéliumokban expresszálódnak, és hozzájárulnak a sejtmembránok passzív kloridáramlással szembeni permeabilitásához. Kulcsszerepet játszanak a nefron felszálló végtagjában és disztális tubulusaiban, mivel az elsődleges vizeletből az apikális membránon keresztül történő transzportot követően basolaterális útvonalat biztosítanak a klorid reabszorpcióhoz. A CLCKB gén, amely a CLC-KB-t kódolja, egyike a Bartter-szindróma hátterében álló öt génnek. A CLC-KB funkcióvesztéses mutációi hibás klorid-reabszorpciót eredményeznek, és így sópazarló rendellenességhez vezetnek, amely poliuriával jár együtt. A CLC-KB mutációkkal érintett egyének (Bartter III. típus) egyik fő jellemzője az alacsony vérnyomás. A betegség egy súlyosabb formáját a BSND gén mutációi okozzák (Bartter IV. típus), amely a Barttint kódolja, amely egy járulékos fehérje, amely fontos mind a CLC-KA, mind a KB plazmamembránba történő szállításában18. A betegségnek ez a formája szenzoros süketséget is magában foglal, amelyet feltehetően a CLC-KA és a KB belső fülben lévő hámmembránok felé történő mozgásának elvesztése okoz. Feltehetően a CLC-KA vagy a KB aktivitásának elvesztése, de nem mindkettő, tolerálható a hallórendszer számára. Ez arra utal, hogy a CLC-KA vagy a CLC-KB szelektív gátlói, vagy mindkettő részleges gátlása új hurokdiuretikumként működhet, amely alkalmas lehet a vérnyomás csökkentésére, és kevés mellékhatással jár. Ez vezetett farmakológiájuk tanulmányozásához és új, alacsony mikromoláris affinitású inhibitor-származékok kifejlesztéséhez19 , amelyek patkányoknak adva diuretikus hatást fejtettek ki20. Másrészt a CLC-KB csatornákat aktiváló gyógyszerek fokozhatják a hibás csatornák maradék aktivitását Bartter III. típusú betegeknél.

CLC-7

A 2Cl-/H+ csere transzporter alosztályból a CLC-7 a gyógyszerhatás ígéretes célpontja, és gátlása előnyös lehet csontritkulásban. Ez az indikáció ismét a CLC-7 funkcióvesztéses mutációi által okozott humán betegségek megfigyeléseiből ered, amelyek osteropetrozist okoznak21. Ebben a betegségben az oszteoklasztok által végzett csontátalakítás hiányos, amit feltehetően a hibás sav- és enzimszekréció okoz. Ez sűrű csontozatot eredményez, amelyet ha egy CLC-7 gátlóval reprodukálnának, csökkenthetnék a csont felbomlását, és így erősíthetnék a csontritkulásos betegek csontvázát22,23. A koncepciót bizonyító vizsgálatokban a savképződés farmakológiai gátlása24 vagy a CLC-7 működésének antitestekkel25 történő megzavarása csökkentette a csontfelszívódást. A CLC-7 gátlása azonban nem biztos, hogy komplikációmentes, mivel humán és egér vizsgálatok arra utalnak, hogy a CLC-7 funkció hiánya a csökkent lizoszómális funkció miatt neuronális tárolási és degenerációs rendellenességekkel is összefüggésbe hozható26.

Funkcióvesztéses humán mutációk – a CFTR tanulságai

Ezzel a ponttal kapcsolatban érdemes egy rövid szünetet tartani, hogy az új CLC célzott gyógyszerek terápiás indikációinak egy része a spektrumnak a CLC hibás működése által okozott rendellenességektől eltérő és ellentétes végletű rendellenességek kezelésére irányul. A fent leírtakon kívül a Dent I. betegség egy X-kromoszómás vesebetegség, amelyet a CLC-5 működésének elvesztése okoz (lásd27 egy nemrégiben készült áttekintést). Mindegyik ritka öröklődő rendellenesség, és a fehérje fő hibája vagy a fehérje csökkent aktivitásával vagy a célmembránba történő transzportálással jár. Valójában számos egyedi mutáció ER-visszatartást és a fehérje érésének hiányát okozza. Párhuzamot lehet vonni a cisztás fibrózissal, ahol az érintettek többsége az ER-visszatartó ΔF508 mutációval rendelkezik. A cisztás fibrózis kezelésének legújabb és rétegzett megközelítései a mutáns fehérje hajtogatásának korrigálására (CF-korrektorok) és/vagy a plazmamembrán CFTR-kloridcsatornák aktivitásának növelésére (CF-potenciátorok) irányuló kettős támadás eredménye. A potenciátorok osztálya sikerrel kecsegtet28 , amelyek a CFTR aktivitását a fehérje bioszintézisének vagy kereskedelmének elvesztése nélkül csökkentő mutációkkal (pl. G551D) rendelkező betegeknél hatékonyak, azonban a folding-korrektorok hatékonyságát (amelyre az esetek többségében szükség van) még nem sikerült megállapítani29. Bár a CLC funkcióvesztéssel járó betegségek mindegyike ritka genetikai rendellenesség, egy napon talán képesek leszünk a myotoniában, Bartter-szindrómában, Dent-kórban és osteopetrosisban, valamint cisztás fibrózisban szenvedő egyéneket olyan gyógyszerekkel kezelni, amelyek korrigálják a rendellenességük tényleges okát.

Kalcium-aktivált kloridcsatornák

Végül említést teszünk a kalcium-aktivált kloridcsatornákról (ClCa), amelyeknek számos sejttípusban egyértelműen meghatározott élettani szerepük van, molekuláris azonosításuk azonban néhány téves és dadogós kezdetet szenvedett. A történet négyféle fehérjét érint: a CLCA, a Bestrophin, a Tweety és a TMEM16 géncsalád tagjait. Rekombináns túlkifejezésük minden esetben membrán kloridáramok keletkezését eredményezte, amelyeket az intracelluláris kalciumkoncentráció emelése és – különböző mértékben – a membrán depolarizációja serkent. A CLCA útja akkor ért véget, amikor kiderült, hogy ez a fehérje szekretálódik, de valószínűleg az expressziós rendszerben endogén ClCa-csatornák membrán-expresszióját is felszabályozza30. A Tweety és a Bestrophin fehérjék nem rendelkeznek a fontosabb szövetekben vizsgált ClCa csatornák összes tulajdonságával, bár a Best1 felelősnek tűnik a ClCa egy komponenséért az érzékelő neuronokban31 , és fontos szabályozója lehet az endoplazmatikus retikulumból történő kalciumfelszabadulásnak is32,33 . Három független tanulmány a TMEM16A-t (más néven Ano1) javasolta a kalcium-aktivált kloridcsatorna egyik fő komponensének jelöltjeként, ha nem is teljes egészében34-36 . Számos későbbi vizsgálat, amelyet a molekuláris eszközök létrehozása megkönnyített, alátámasztotta ezt. A TMEM16A fontos a membránok gerjeszthetőségének szabályozásában az érrendszeri simaizomzatban, a pulmonális hipertónia állatmodelljében felszabályozódik, és a tónus csökkenthető a csatorna gátlásával37,38 . Érzőidegsejtekben a TMEM16A a gyulladásos mediátorok jelenlétét a membránok túlgerjesztettségéhez kapcsolja, és a TMEM16A gátlása antinociceptív hatású39. Az asztma állatmodelljeiben ennek a bizonyos kloridcsatornának az expressziója fokozott, és gátlása jótékony hatású lehet40. A bél Cajal intersticiális sejtjeiben is megtalálható, és a csatorna működése szükséges a bélfal simaizomzatának ritmikus összehúzódásához41. Továbbá a TMEM16A aktiválása alternatív útvonalat biztosíthat a cisztás fibrózisban a hám kloridszekréciójához42. Míg a TMEM16 család többi tagjának pontos funkciója körül még mindig van némi vita, a ClCa funkciót a TMEM16B-nek (Ano2) is tulajdonítják, amelyről úgy gondolják, hogy a szaglószőrsejtek ClCa-csatornája mögött áll43,44. Az ioncsatornák ezen osztályának a rákos sejtek biológiájában is lehet szerepe, és gátlása megakadályozhatja a sejtproliferációt45-48.

Záró megjegyzések

Ez az áttekintés rávilágított a kloridot vezető vagy transzportáló fehérjék sokféle szerepére, és arra, hogy diszfunkciójuk hogyan párosul emberi rendellenességhez vagy betegségszerű tünetekhez állatmodellekben. Súlyos hiány van olyan farmakológiai reagensekből, amelyek gátolják, aktiválják vagy javítják a kloridcsatornák és transzporterek membránforgalmát. A cisztás fibrózisban a CFTR hibás működését visszafordító gyógyszerek terén előrelépés tapasztalható, ami remélhetőleg az öröklődő mutáció különböző típusaira specifikus gyógyszereket eredményez majd. A TMEM16A kalcium-aktivált kloridcsatornák42,49 gátlói és aktivátorai hasznos laboratóriumi eszközöknek bizonyulnak, és az új vegyületek hatékony gyógyszerek lehetnek, különösen, ha szövetspecifikus hatást tudnak kifejteni. Az egyes CLC-kre specifikus molekulák valószínűleg a legnehezebben elérhetőek. A feszültségvezérelt CLC-k aktiválódásának50 szerkezeti alapjainak megértése azonosíthatja azokat a fehérjetartományokat, amelyek a racionális szerkezetalapú gyógyszertervezés célpontjai lehetnek. Az ilyen eszközök lehetővé teszik majd, hogy az itt áttekintett és bemutatott új terápiás ötletek közül néhányat próbára tegyünk.

A szerző életrajza

Dr Jon Lippiat a káliumcsatornák szerkezetével, működésével és farmakológiájával kapcsolatban a Leicesteri Egyetemen doktorált. Az Oxfordi Egyetemen tanulmányozta a hasnyálmirigy béta-sejtek működését és a cukorbetegséget, mielőtt a Leedsi Egyetem farmakológiai lektorává nevezték ki. Kutatásai számos különböző típusú ioncsatorna és transzporter szerkezeti és fiziológiai tulajdonságainak, valamint új farmakológiai reagensekkel való potenciális célzott kezelésüknek a tisztázására irányulnak.