Rajskub első szerepe egy közösségi színházi előadásban, a Willy Wonka & a csokoládégyárban volt, első főszerepe pedig Raggedy Ann volt. 1996-ban szerepelt a Weezer “The Good Life” és Beck “The New Pollution” című dalaihoz készült klipekben.
1996-1998 között visszatérő szerepe volt az HBO The Larry Sanders Show című sorozatában Mary Lou Collins foglalási asszisztenseként.
Legismertebb szerepe a CTU rendszerelemzője, Chloe O’Brian a 24-ben, amelyhez 2003-ban, a sorozat harmadik évadának kezdetén csatlakozott. Karaktere nagy sikert aratott a nézők és a kritikusok körében, és egyike volt azon kevés szereplőnek, aki visszatért a sorozat negyedik évadában. Miután két évadon keresztül rendszeres vendégszereplő volt, Rajskub a sorozat ötödik évadában főszereplő lett. A sorozat végére ő lett a női főszereplő, aki Kiefer Sutherland után a második helyen állt. Az ő karakterét érte az a megtiszteltetés is, hogy ő mondhatta ki a sorozat utolsó szavait a 8. évad sorozatfináléjában. Rajskub és Sutherland rövid ideig a 24 karakterükként szerepeltek a The Simpsons című Fox animációs sorozat 2007-es epizódjában, a “24 perc” címűben. 2013 augusztusában bejelentették, hogy újra eljátssza Chloe O’Brian szerepét a 2014-es 24: Live Another Day című limitált sorozatban.
Rajskub egyike volt a Mr. Show eredeti szereplőinek. Szerepelt Kelsey Grammer The Sketch Show című sorozatában a Fox televízióban, a The King of Queensben egy Priscilla nevű karakterként, valamint számos filmben, köztük a Titokzatos bőr, a Legally Blonde 2, a Sweet Home Alabama, a Haver, hol a kocsim? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, Beck, Weezer és Sheryl Crow klipjei, valamint egy vak nőt alakított a Road Trip című filmben.
Rajskub tagja volt a Girls Guitar Club nevű komikus duónak (Karen Kilgariffal). 2006-ban cameószerepet vállalt a Gilmore Girls 6. évadának fináléjában, a “Partings”-ban, ahol egy trobairitzot alakított, aki a nagy áttörést keresi. (Rajskub korábban már szerepelt a Gilmore Girlsben, mint női főszereplő az A Film by Kirk című rövidfilmben, amelyet Kirk Gleason karaktere készített.) Önkéntes színésznőként részt vett a Young Storytellers Programban. Végzettségét tekintve festő, a San Francisco-i Művészeti Intézetbe járt.
Rajskubot kétszer jelölték Screen Actors Guild-díjra; egyszer 2005-ben, majd 2007-ben egy drámai sorozatban nyújtott kiemelkedő társulati alakításért. Vendégszerepelt a Flight of the Conchords “Prime Minister” című epizódjában, mint Karen, egy Art Garfunkel fanatikus. Vendégszerepelt “Gail, a csiga” szerepében az It’s Always Sunny in Philadelphia “The Gang Gives Frank an Intervention” című epizódjában, és újra eljátszotta ezt a szerepet a kilencedik évad fináléjában, a “The Gang Squashes Their Beefs” és a tizenharmadik évad “The Gang Beats Boggs” című epizódjában: Hölgyek újraindítása”. 2009-ben szerepelt a Julie & Julia című filmben is, mint Sarah, Julie Powell egyik közeli barátnője. 2010-ben Rajskub stand-upot adott elő John Oliver New York Stand Up Show című műsorában. 2010 júniusában szerepelt a Royal Pains című amerikai sorozat második évadának “Lovesick” című epizódjában.
2010 júliusától októberéig a Los Angeles-i Steve Allen Színházban lépett fel Mary Lynn Spreads Her Legs című szólóműsorával. A Los Angeles Times kritikusa, F. Kathleen Foley azt írta, hogy “ez a vidáman vulgáris cím összefoglalja az általános hangnemet, amely gyakran könnyedén obszcén”. A műsort, amelyet Rajskub írt Amit Itelman rendező/fejlesztő segítségével, Rajskub terhességgel, szüléssel és korai anyasággal kapcsolatos tapasztalatai ihlették.
2011 januárjában Rajskub vendégszerepelt az ABC Modern Family második évadának “Gyermekeink, mi magunk” című epizódjában. 2011 őszén Rajskub szerepelt a How to Be a Gentleman című rövid életű sitcomban. Szintén 2011-ben kezdődött Rajskub Dicki című websorozatának sugárzása a My Damn Channelen. Dicki számos olyan emberen alapul, akik között Rajskub Michiganben és környékén nőtt fel. A címszereplő egy 40 éves nő, aki otthon él a szüleivel, kézműveskedik, és komolyan veszi a művészetét. A Dicki a My Damn Channel egyik legsikeresebb websorozata volt eddig. Az első évad 2011 novemberében ért véget, de a második évad jelenleg fejlesztés alatt áll. Rajskub szerepelt a 2012. júniusi Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling) című havi showcase-ben, amelyben hírességek olyan igaz történeteket osztanak meg, amelyekről soha nem szeretnék, ha édesanyjuk tudna. Jelenleg egy podcast házigazdája a Nerdist Networkön Kickin’ it Mary Lynn Style címmel.
2013-ban Rajskub feltűnt az Arrested Development negyedik évadában egy csendes, de jól fogadott szerepben, mint Heartfire, egy karakter, akiről Rajskub azt mondta, hogy “szívből beszél, de nem használ szavakat”. Ugyanebben az évben Rajskub szerepelt az All Growz Up című websorozatban is Melinda Hill-lel.
Rajskub 2015. március 27-én megjelent Ken Reid TV Guidance Counselor podcastjében.
2016 augusztusában Rajskub megjelent az Edinburgh Festival Fringe-en a 24 Hours With Mary Lynn Rajskub című filmben, amit a rajongók és a kritikusok is jól fogadtak.
2017-ben Rajskub szerepelt az Adult Swim sorozatának, a Dream Corp LLC-nek az első évadában, ahol a 46-os beteget alakította a “Are You Down With OCD?” című epizódban.
2018-ban Rajskub szerepelt a Night School című filmben Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe és Keith David oldalán.
2021-ben Rajskub egy 49 perces komédia különszámot adott ki Mary Lynn Rajskub címmel: Live from the Pandemic; ez több video-on-demand szolgáltatáson keresztül kölcsönözhető vagy megvásárolható.