4.3. A nikotinreceptor szerkezete
Az elektromos szerv és a gerinces vázizomzat nikotinreceptora egy pentamer, amely négy különböző alegységből (a, b, g és d) áll 2:1:1:1:1 sztöchiometriai arányban. Az érett, innervált izomvéglemezekben a g alegység helyébe egy közeli rokon alegység, az e lép. Az egyes alegységek aminosavszekvenciája körülbelül 40%-ban azonos, egy közös ősgénből származnak. A nikotinreceptor lett a prototípusa más pentamer ligandumkapcsolt ioncsatornáknak, amelyek közé tartoznak a gátló aminosavak (g-aminovajsav és glicin) és egyes szerotonin (5-HT3) receptorok receptorai. A pentamer receptor minden egyes alegysége 40 000-60 000 dalton molekulatömegű. Az amino-terminális 210 maradék gyakorlatilag a teljes extracelluláris domént alkotja. Ezt négy transzmembránon átívelő (TM) domén követi; a harmadik és negyedik domén közötti régió alkotja a citoplazmatikus komponens nagy részét. A nikotinos ACh-receptoron belül minden alegységnek van egy extracelluláris és egy intracelluláris kitettsége a posztszinaptikus membránon. Az öt alegység egy pszeudo-szimmetriatengely körül helyezkedik el, hogy körülírjon egy belül elhelyezkedő csatornát.
A receptor egy aszimmetrikus molekula (14 nm×8 nm) 250 000 daltonnal, a nem membránon átívelő domén nagy része az extracelluláris felületen található. A csomóponti területeken (azaz a vázizomzat motoros véglemezén és az elektromos szerv ventrális felszínén) a receptor nagy sűrűségben (10 000/mm2), szabályos pakolási rendben van jelen. A receptoroknak ez a rendezettsége lehetővé tette a molekuláris szerkezetének elektronmikroszkópos képi rekonstrukcióját. Édes- és sósvízi csigákban azonosítottak egy ACh-kötő fehérjét, amely csak a nikotinreceptor extracelluláris doménjével homológ, és szerkezetileg és farmakológiailag jellemezték.
Ez a fehérje homomer pentamerré áll össze, és a nikotinreceptor ligandumokat a várt szelektivitással köti; kristályszerkezete a nikotinreceptortól elvárt atomi szerveződést mutatja. Továbbá, az ACh-kötő fehérje és a receptor transzmembrán szakaszainak fúziója egy olyan funkcionális fehérjét eredményez, amely a receptortól elvárt csatornabecsapódást és állapotváltozásokat mutatja. Ez a kötőfehérje a receptor szerkezeti és funkcionális helyettesítőjeként is szolgál, és lehetővé tette a nikotinreceptor ligandspecifikusságát meghatározó tényezők részletes megértését. Az agonistakötő helyek az alegységek határfelületein találhatók, de az izomban az öt alegységből csak kettő, az a g és az a d határfelület fejlődött ki a ligandumok megkötésére. Az agonisták, a reverzibilis kompetitív antagonisták és az elapid a toxin kötődése kölcsönösen kizárja egymást, és átfedő felületeket érint a receptoron. Az alegység-felületet alkotó mindkét alegység hozzájárul a ligand-specifikussághoz. A membrán konduktanciák mérései azt mutatják, hogy az iontranszlokáció sebessége kellően gyors (5×107 ion másodpercenként) ahhoz, hogy az iontranszlokáció nem egy forgó ionhordozó, hanem egy nyitott csatornán keresztül történjen. Továbbá, az agonista által közvetített változások az ionpermeabilitásban (jellemzően elsősorban Na+ és másodsorban Ca2+ befelé irányuló mozgása) egy, a receptor szerkezetében rejlő kationcsatornán keresztül történnek. Az öt alegység mindegyikén található második transzmembránon átívelő régió alkotja a csatorna belső peremét. Az agonista-kötőhely szorosan kapcsolódik az ioncsatornához; az izomreceptorban két agonista molekula egyidejű kötődése gyors konformációs változást eredményez, amely megnyitja a csatornát. Mind a kötődési, mind a kapuválasz pozitív kooperativitást mutat. A csatornanyitás kinetikájának részletei az elektrofiziológiai patch-clamp technikákból fejlődtek ki, amelyek megkülönböztetik egyetlen receptormolekula egyedi nyitási és zárási eseményeit, és megerősítik, hogy a nikotinos acetilkolin receptorok (nAChR) pentamer ligandgátolt ioncsatornák, amelyek olyan alegységekből állnak, amelyek egy extracelluláris doménből állnak, amely a ligandumkötő helyet és egy különálló ionpórus-domént hordoz. A jelátvitel a két domén közötti allosztérikus csatolás eredménye, ezek távolsága a kötőhelytől a pórusdomén kapujáig 50 Å. A receptorok kötődését vizsgáló vizsgálatok azonban specifikusak a nikotinos kolinerg receptorokra, amelyeket a Rana catesbiana és a Rana temporaria békák izolált vestibularis epithéliumán végeztek. Bizonyítékokat mutatnak be a nikotinszerű kolinerg receptorok jelenlétére, amelyek specifikusan az érzékszervi területekhez kapcsolódnak, és tanulmányozták az altípus-szelektivitást biztosító atipikus nikotin agonista konformációk kötődését, és arra a következtetésre jutnak, hogy a nAChR-nek döntő szerepe van az izgalmi neurotranszmisszióban, és fontos célpontot játszik a gyógyszerek és rovarölő szerek számára. Különböző nAChR altípusok különböző alegység-kombinációkkal, amelyek különböző szelektivitást biztosítanak a nikotinos gyógyszerek számára, és azonosított olyan géncsaládot is, amely az izmok nikotinos acetilkolin receptorának α alegységével homológ fehérjéket kódol a patkány genomban. Ezek a gének a központi és a perifériás idegrendszerben íródnak át olyan területeken, amelyekről ismert, hogy funkcionális nikotinreceptorokat tartalmaznak. A β2-tartalmú neuronális nikotinreceptorok (nAChR) szerepe a nikotin magzati és újszülöttkori mellékhatásainak közvetítésében. A β2 nAChR alegységet nem tartalmazó vemhes WT és mutáns egerekbe ozmotikus minipumpákat ültettek be, amelyek vagy vizet, vagy ellenőrzött dózisú nikotint juttattak. Ezt követően az utódok szimpatoadrenális rendszerének fejlődését, valamint légzési és arousal reflexeit röviddel a születés után összehasonlították, ami a nikotin expozícióval szembeni fokozott sebezhetőség időszakát jelenti. Másrészt a neonikotinoidok, mint az imidakloprid, erős rovarölő hatással rendelkező nAChR-agonisták. Az 1990-es évek eleji bevezetése óta az imidakloprid az egyik legszélesebb körben használt rovarölő szer lett mind a növényvédelmi, mind az állategészségügyi alkalmazásokban, az imidakloprid rezisztencia molekuláris alapjait, öt nAChR alegységet (Nlα1-Nlα4 és Nlβ1) klónoztak a Nilaparvata lugensből. Az imidakloprid-érzékeny és az imidakloprid-rezisztens populációkból származó nAChR alegység génjeinek összehasonlítása egyetlen pontmutációt azonosított egy konzervált pozícióban (Y151S) két nAChR alegységben, az Nlα1-ben és az Nlα3-ban. Az Y151S pontmutáció gyakorisága és az imidaklopriddel szembeni rezisztencia szintje között erős korrelációt mutattak ki allélspecifikus PCR segítségével. A Nilaparvata lugens α és patkány β2 alegységeket tartalmazó hibrid nAChR-ek expressziójával bizonyítékot nyertünk arra, hogy az Y151S mutáció felelős a specifikus imidakloprid-kötődés jelentős csökkenéséért. Ez a tanulmány közvetlen bizonyítékot szolgáltat a neonikotinoid rovarölő szerrel szembeni target-site rezisztencia előfordulására, és vizsgálta a kation-π kötőhely természetét a nikotinreceptorban, és megállapította, hogy a nikotinos acetilkolinreceptor a ligandum-függő ioncsatorna prototípusa. Számos aromás aminosavat azonosítottak, amelyek hozzájárulnak az agonista kötőhelyhez, ami arra utal, hogy a kation-π kölcsönhatások részt vehetnek az agonista, az acetilkolin kvaterner ammóniumcsoportjának megkötésében. A kolinerg molekulák konformációja a nikotinos idegreceptorokon, és korrelációt talál az erős nikotinos agonisták, az acetil-kolin, az acetil-α-metil-kolin, a laktoil-kolin, az 1,1-dimetil-4-fenil-piperazin és a nikotin kristályszerkezeti elemzései alapján lehetővé teszi a nikotinos idegreceptorok szempontjából releváns kolinerg agonisták konformációjának meghatározását. A három humán glióma-sejtvonalból izolált mRNS-ek által kódolt neurotranszmitter-receptorok expressziója. A két glioblasztóma-sejtvonalból származó mRNS-sel injektált óociták nem mutattak elektromos választ a különböző vizsgált neurotranszmitterekre.
A nAChR sztrichninnel történő modulációja megállapítja, hogy a sztrichnin a glicinreceptorok erős és szelektív antagonistája, amely gátolja a Xenopus oocitákban kifejezett izom (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ és α 1β 1δ) és neuronális (α 2β 2 és α 2β 4) nikotinos acetilkolin receptorokat (AcChoRs). A sztrichnin önmagában (500 µmol/L-ig) nem váltott ki membránáramot az AcChoRs-t expresszáló oocitákban, de amikor acetilkolin (AcCho) szuperfúziója előtt, azzal egyidejűleg vagy közben alkalmazták, gyorsan és reverzibilisen gátolta az AcCho által kiváltott áramot (AcCho-áram). A nAChR-eket kódoló exogén hírvivő RNS fordítása Xenopus oocitákban funkcionális receptorokat hoz létre, ebben a vizsgálatban a Torpedo elektromos szervéből kivont hírvivő RNS-t Xenopus oocitákba injektálták. Ez funkcionális acetilkolinreceptorok szintéziséhez és beépüléséhez vezetett az oocita membránjába. Amikor acetilkolin aktiválta őket, ezek a Torpedo-acetilkolin-receptorok az oocita membránjában olyan csatornákat nyitottak, amelyek ionáteresztő képessége hasonlított a más sejtekben lévő nikotinreceptorokéhoz.
Az acetilkolin receptorok (AChR) lokalizációját a csirkeembrió elülső és hátsó latissimus dorsi izmainak fejlődő myogén sejtjeinek felszínén az innerváció folyamatával összefüggésben ultrastrukturális szinten vizsgálták torma-peroxidáz-α-bungarotoxin konjugátum felhasználásával. Az AChR lokalizált koncentrációját találtuk kis régiókban 0,1-0.4 µm szélességben a 10-14 napos izmok myogén sejtjeinek felszínén, valamint vizsgálták az acetilkolin és a fiziológiás hatását utánzó vagy blokkoló szerek hatását a guanozin 3′ koncentrációjára:5′-ciklikus monofoszfát (ciklikus GMP) és az adenozin 3′:5′-ciklikus monofoszfát (ciklikus AMP) koncentrációjára emlősök agykéreg, szívkamra és bélcsatorna szeletekben. Az acetilkolin és a túlnyomórészt muszkarin hatású kolinomimetikus szerek, mint a metakolin, a bétanechol és a pilokarpin, mindhárom vizsgált szövetben a ciklikus GMP koncentrációjának növekedését vagy a ciklikus AMP koncentrációjának enyhe csökkenését idézték elő.
A humán neuronális α7 AcCho receptor (α7 AcChoR) és annak L248T mutált (mut) formájának funkcionális tulajdonságait és sejtes lokalizációját úgy vizsgálták, hogy önmagukban vagy génfúzióként a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) fokozott változatával expresszálták őket. A vad típusú, mutα7 vagy a kiméra alegység cDNS-ekkel injektált Xenopus oociták olyan receptorokat fejeztek ki, amelyek AcCho hatására membránáramokat kapcsoltak. Mint már ismert, a wtα7 receptorok által generált AcCho áramok sokkal gyorsabban lecsengenek, mint a mutα7 receptorok által kiváltott áramok. A β2 nikotinos receptorok és a dopamin útvonalak kölcsönhatása a spontán mozgás szabályozásában, és megállapítja, hogy az acetilkolin (ACh) a dopaminerg (DAerg) neuronok aktivitásának ismert modulátora a nAChR-ok stimulálásán keresztül. Mégis, a DA-mediált lokomócióban részt vevő nAChR-ok alegység-összetételét és specifikus elhelyezkedését in vivo még nem sikerült megállapítani. A nAChR-ok β2 alegységét (β2KO) nélkülöző egerek feltűnő hiperaktivitást mutatnak a nyílt terepen, ami a DA neurotranszmisszió egyensúlyhiányára utal. A nikotinreceptor M2 doménjén belüli mutáció azonban az 5-hidroxitriptamint antagonistából agonistává alakítja, a vizsgálatot az 5-hidroxitriptamin (5HT) homomerikus neuronális nikotinreceptorokra (nAcChoR) gyakorolt hatásaira végeztük, amelyeket Xenopus oocitákban fejeztek ki a vad típusú csirke alegységet kódoló cDNS befecskendezése után. Az AcCho nagy áramokat váltott ki, amelyeket az 5HT reverzibilis és dózisfüggő módon, félgátló koncentrációval és Hill-együtthatóval csökkentett. Bár a citotoxikus T-limfociták kolinerg receptorának tanulmányozása és a kolinerg agonisták a szenzitizált limfociták azon képességét, hogy a szenzitizáló alloantigéneket hordozó sejteket károsítsák, a támadó limfocita populáció kolinerg receptorát egy olyan in vitro rendszer farmakológiai manipulációjával tanulmányozták, amely a szenzitizált támadó sejtek által a célsejteken közvetített károsodást számszerűsíti.