Subklinikai agysérülés H5N1 influenzavírus fertőzés okozta szubklinikai agysérülés

TEXT

A humán influenzavírusok általában a felső légutakat fertőzik, tüsszögést, orrfolyást és köhögést, valamint lázat, rossz közérzetet és ízületi fájdalmat okozva (22). Emellett neurológiai szövődményekről is beszámoltak, amikor az influenzavírus új altípusa kerül az emberi populációba, amint azt a spanyol (1918) és az ázsiai (1957) járványok példázzák (2-4, 6, 10, 18, 22).

1997-ben a baromfiból származó H5N1 influenzavírus okozott járványt az emberekben. Azóta világszerte több mint 500 ember fertőződött meg H5N1 vírussal, a halálozási arány megközelítőleg 60% volt (21). Az emberi H5N1-vírusfertőzés általában súlyos tüdőgyulladásban nyilvánul meg, amely akut légzési distressz szindrómába torkollik; néhány H5N1-vírusos áldozatnál azonban neurológiai tünetek is jelentkeztek (1). H5N1 vírus RNS-t és antigéneket mutattak ki a betegek agyában, és magát a vírust is izolálták agy-gerincvelői folyadékból (5, 7) Ezek az adatok arra utalnak, hogy egyes H5N1 vírusok agyvelőgyulladást okozhatnak az emberekben, ahogyan az a spanyol és az ázsiai világjárvány korai szakaszában történt.

A szarvasmarhák az influenzafertőzés hasznos emlős modelljét jelentik, mivel rendkívül fogékonyak az influenzavírusokkal való fertőzésre, és az influenza néhány olyan tünete alakul ki náluk, mint az embernél (8, 12, 14, 16, 19). A H5N1 influenzavírus intranazális expozíciót követő neuroinvazivitásáról görény modellben is beszámoltak (23). Ezért a H5N1 vírusfertőzés hosszú távú neurológiai hatásainak tanulmányozására görényeket fertőztünk meg az állatokban enyhe tüneteket okozó H5N1 vírusokkal, és 9 hónapon keresztül figyeltük a központi idegrendszerre (CNS) gyakorolt hatásokat. Azt is igyekeztünk tisztázni, hogy ezek a H5N1-vírusok milyen úton hatoltak be a központi idegrendszerbe.

A hat hónapos görényeket intranazálisan oltottuk be 106 PFU A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) vagy A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486) vírussal. Ezeket a vírusokat Madin-Darby kutyavese (MDCK) sejtekben szaporítottuk 0,3% szarvasmarha szérumalbuminnal kiegészített minimál esszenciális táptalajban. A 3., 6. és 12. napon, valamint a fertőzés utáni 1., 3., 6. és 9. hónapban (p.i.) szövetmintákat vettünk vírusizolálás és patológiai vizsgálat céljából. A görények letargikusak voltak, és a légúti fertőzés jeleit és tüneteit mutatták az első 10 napban, de nem mutattak számottevő neurológiai tüneteket, ami ellentétben áll a korábban közölt eredményekkel (23). Az orrmandulákból, tüdőből, légcsőből, agyból, májból, lépből, veséből, szívből, hasnyálmirigyből és gerincvelőből származó szövetmintákat vettünk, és foszfáttal pufferelt sóoldattal 10%-os szuszpenzióvá homogenizáltuk. Az egyes szövetekben a vírustitereket plakk-tesztek segítségével határoztuk meg. A vírusok főként az orrmelléküregekben szaporodtak, a vírustiterek p.i. 3-6 napra elérték a 105-106 PFU/gramm szövetet (1. táblázat). A HK483- vagy HK486-fertőzött görényekből gyűjtött agyszöveteket 10%-os semleges pufferelt formalinban tartósítottuk és feldolgoztuk paraffinbeágyazáshoz. A paraffinba ágyazott szöveteket 5 mm vastag szeletekre vágtuk, és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük. További metszeteket vágtunk immunhisztológiai festéshez H5 influenzavírus elleni nyúl poliklonális antitestekkel. A szövettani vizsgálat neuronális inváziót vagy károsodást mutatott ki, beleértve a plexus chorioidea gyulladását is (2. táblázat). A HK486 vírussal fertőzött görényeknél nem szuppuratív gyulladás (1a. ábra) és vírusantigén-expresszió (1b. ábra) volt kimutatható, amely 12 napig fennállt; a vírusantigének nem voltak kimutathatók az i. e. 1. hónapban. A nem szuppuratív encephalitis 3 hónapig tartott (1c. ábra), és az i. e. 6. és 9. hónapban maradék gliális hegesedés volt látható azokon a területeken, ahol a korábbi fázisban vírusantigéneket mutattak ki (1d. ábra). Továbbá a HK486-tal fertőzött görények a 12. napon a szaglórendszer makroszkópos sérülését mutatták (1e. és f. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy bár a magas patogenitású H5N1 vírusok elsősorban a gazdaszervezet légútjait érintik (1), neurológiai szövődményeket is okozhatnak. A HK486 vírussal ellentétben, amely behatolt a görények agyi parenchimájába és súlyos parenchimakárosodást okozott, a második H5N1 vírustörzs, a HK483 súlyos, nem szuppuratív vasculitist okozott a görények agyában 6 napos p.i. állapotban látható parenchimakárosodás nélkül. Bár vírusantigént nem lehetett kimutatni az érrendszerben, az érkárosodás nyilvánvaló volt, amit endotélduzzanat (2a. ábra, nyílhegyek), elszórt apoptotikus sejtek (2b. ábra, nyílhegyek), valamint makrofágok (2a. ábra, nyilak) és polimorfonukleáris leukociták (2b. ábra, nyíl) intramurális infiltrációja jellemzett. A thalamusban, a szürke és a fehérállomány találkozásánál és az agytörzsben érelváltozásokat találtak. A p.i. 1 és 6 hónapos korban vizsgált agyminták krónikus és ismételt perivaszkuláris vérzésre utaló vérzéses elváltozásokat mutattak (2c. ábra) a talamuszban, a kisagyban és az előagy subarachnoidalis terében (2d. ábra). Ezek a megfigyelések összhangban vannak az influenzavírus okozta vérzéses agyi szövődményekről szóló jelentésekkel az éves járványok során (11). A vírusfertőzéshez másodlagos agyi vasculitis viszonylag gyakori (17), és valószínűleg az érfal törékenységének oka, ami agyvérzéshez vezet. Ezért ésszerűnek tűnik a következtetés, hogy a H5N1 vírusfertőzés emberben hasonló agyvérzést okozhat, mint ami más neurotróp vírusokkal való fertőzéskor megfigyelhető.

A H5N1 vírusok görények agyába való behatolásának útvonalát vizsgálva elemeztük a HK483, HK486, A/Hongkong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) és A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18) vírusokkal fertőzött görényekben megfigyelt agyi elváltozások és vírusantigén-expresszió eloszlását. A HK213, VN1204 és NCVD18 vírusokat MDCK-sejtekben szaporítottuk 0,3% szarvasmarha-szérumalbuminnal kiegészített minimál esszenciális táptalajban. A hat hónapos görényeket intranazálisan beoltották 106 PFU vírussal. Az agyszöveteket az akut fázisban, a VN1204 és az NCVD18 esetében 3 és 6 nappal a fertőzés után, a HK213 esetében pedig 12 nappal a fertőzés után gyűjtöttük. A szöveteket H&E festésre és immunhisztokémiai vizsgálatra dolgoztuk fel a szövettani vizsgálathoz. A VN1204, az NCVD18 és a HK213 által okozott agyparenchimális elváltozásokat nem szuppuratív agyvelőgyulladás jellemezte, és a vírusantigének expressziós mintázata lényegében megegyezett a HK486-éval (az adatok nem láthatóak). Az agyi elváltozások és a vírusantigének háromdimenziós (3D) eloszlásának megértése érdekében 3D képalkotással (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japán) ábrázoltuk azokat egy sárga mongúz (Cynictis penicillata) agyáról, amelynek felépítése nagyon hasonlít a görényagyéhoz (20). A szaglópálya (azaz a szaglásért felelős szenzoros pálya) vizualizálásához a 3D-képeken referenciakeretként megjelöltük a szaglógumótól a piriform kéregig vezető idegpályákat (3a. ábra, sárga; lásd még a kiegészítő anyagban az S1 filmet). A különböző H5N1 influenzavírusok által okozott, vírusantigénnel és vírusantigén nélküli agyi elváltozások három különböző mintázatát találtuk: a csak a szaglópálya mentén eloszló (3b. és c. ábra, szaggatott sárga vonal; lásd még az S2 és S3 filmeket) (HK213 és NCVD18); a szaglópálya mentén észlelt (3b. és c. ábra, szaggatott sárga vonal; lásd még az S2 és S3 filmeket); a szaglópálya mentén észlelt (3b. 3d. és e. ábra, szaglóút, szaggatott sárga vonal; lásd még az S4 és S5 filmeket) és az agytörzsben (3d. és e. ábra, fehér nyilak; lásd még az S4 és S5 filmeket) (HK486 és VN1204); és az egyéb területeken (3f. ábra; lásd még az S6 filmet) (HK483). Az elváltozások harmadik csoportjának a másik két csoporttól való elkülönítésének alapja jobban látható, ha az elváltozások eloszlását hátulról vizsgáljuk (3g. és h. ábra, sárga versus kék versus piros). Ezek a térképezési eredmények azt jelzik, hogy az általunk vizsgált H5N1 törzsek többsége a szaglási útvonalon keresztül hatolt be az agyba (3. ábra, szaggatott sárga vonal). Az egyik kivétel a HK483 törzs volt (3f. ábra), amely görényekben egyértelműen az agyi érrendszert célozta meg, és a szaglórendszeren kívüli elváltozásokat okozott.

Mielőtt a H5N1 vírusok világjárvánnyá válhatnak, valószínűleg el kell sajátítaniuk azt a képességet, hogy jól növekedjenek az emberi légutak felső részén, ami hatékony emberről emberre terjedéshez vezetne tüsszentés és köhögés útján (13, 22). A görényekből származó adataink arra utalnak, hogy ha a magas patogenitású H5N1-vírusok megvetik a lábukat az emberben, akkor szubklinikai neurológiai szövődményeket okozhatnak azáltal, hogy az idegpályákon keresztül behatolnak az agyba, vagy agyi vasculitist okoznak. Korábban H3N2 vírust mutattak ki vadászgörény agyában; az agyban lévő vírus mennyisége azonban alacsony volt (kevesebb, mint 102,2 log10 50%-os tojásfertőző dózis), és az agyban lévő vírusantigénekről nem számoltak be (23). Megállapítottuk, hogy a 2009-es pandémiás H1N1 vírus hatékonyabban szaporodott a görények légutaiban, mint a humán szezonális H1N1 vírus (9, 13, 15), és nem szuppuratív szaglógumó-elváltozásokat okozott; azonban ezen állatok agyparenchimájában nem találtunk vírust (az adatok nem láthatóak). Ezért az agyparenchima invázió, amint azt a vírusantigének jelenléte mutatja, a H5N1-vírusok jellemzője. Ezért helyénvaló lenne retrospektív és prospektív vizsgálatokat végezni a H5N1-vírussal fertőzött betegek szubklinikai neurológiai szövődményeire vonatkozóan. Eredményeink aggodalomra adnak okot, hogy a H5N1 vírusok világméretű elterjedésekor szubklinikai neurológiai szövődmények kísérhetik a súlyos légúti fertőzéseket.