Abstract
De etiologie van neurodegeneratieve ziekten (ND) schijnt susceptibiliteitsgenen en omgevingsfactoren te impliceren. Giftige metalen worden beschouwd als belangrijke milieuverontreinigende stoffen. Naar aanleiding van onze studie van een geval van multiple sclerose (MS) verbetering als gevolg van verwijdering van aluminium (Al) en andere toxische metalen, hebben wij de mogelijke relatie tussen Al intoxicatie en ND onderzocht. Wij gebruikten de langzame intraveneuze behandeling met de chelaatvormer EDTA (calcium dinatrium ethyleendiamine tetraazijnzuur) (chelatietest) om Al te verwijderen en detecteerden het in de urine die gedurende 12 uur bij de patiënten werd verzameld. MS-patiënten vertegenwoordigden 85,6% van het totale aantal ND. Al was aanwezig in 44,8% van alle gevallen van ND en gezonde patiënten. Het Al-gehalte was significant hoger bij ND-patiënten dan bij gezonde proefpersonen. Wij tonen hier aan dat behandeling van patiënten met Al-belasting met tien EDTA chelatietherapieën (EDTA intraveneuze toediening eenmaal per week) in staat was om Al-intoxicatie significant te verminderen.
1. Inleiding
Exposure van menselijke populaties aan toxische metalen kan resulteren in schade aan een verscheidenheid van orgaansystemen.
Een van de meest bestudeerde toxische metalen, aluminium (Al), is betrokken bij vele ziekten. Al is een zeer overvloedige en alomtegenwoordige toxische stof in het milieu en de industrie en zit ook in veel voedingsmiddelen; het is betrokken bij skelet-, hematologische en neurologische ziekten. Al-toxiciteit wordt veroorzaakt door verstoring van de homeostase van metalen zoals magnesium, calcium en ijzer (Fe): in feite bootst Al deze metalen na in hun biologische functies en brengt het vele biochemische veranderingen teweeg . In het bijzonder oefent Al directe genotoxiciteit uit in primaire menselijke neurale cellen en induceert het neurodegeneratie door een toename van de accumulatie van Fe en de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Al-geïnduceerde oxidatieve schade aan DNA is eerder in verband gebracht met neurodegeneratie in verschillende regio’s van de hersenen van ratten. Bovendien is onlangs aangetoond dat Al3+ bij de nematode Caenorhabditis elegans transporter-gemedieerde dopaminedegeneratie veroorzaakt.
Het verwijderen van toxische metalen uit het menselijk lichaam kan een nuttig hulpmiddel zijn om het begin of de voortgang van veel ziekten die verband houden met metaalvergiftiging te voorkomen.
De methoden die nuttig zijn om bepaalde metaalgehalten in biologische monsters voor monitoringdoeleinden te bepalen, zijn enkele jaren geleden ontwikkeld. Zowel toxische als essentiële metalen zijn in bloed, urine en haar onderzocht met behulp van atoomabsorptiespectroscopie. Vervolgens zijn methoden ontwikkeld voor de analyse van sporenelementen in menselijke biologische materialen en werd inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS) verkieslijk geacht voor het screenen van meerdere elementen . Het lijkt echter moeilijk om metaalovermaat in bloed en urine aan te tonen in omstandigheden die verschillen van acute metaalintoxicatie. In feite weerspiegelt de toename van toxische metalen in het bloed slechts een recente blootstelling aan metalen . Na acute blootstelling verplaatsen toxische metalen zich snel van het bloed naar vele weefsels, waar ze worden vastgelegd, zoals in het centrale zenuwstelsel (CZS). De enige manier om opgehoopte toxische metalen uit menselijke organen te verwijderen is deze metalen te binden door middel van chelaatvormers, met als doel complexen te vormen die in de urine kunnen worden uitgescheiden. Het gehalte aan toxische metalen kan worden onderzocht in de urinemonsters van patiënten, na “challenge” met een chelaatvormer (“chelatietest”). Van de bekende chelerende agentia hebben wij gekozen voor calciumdinatriumethyleendiaminetetraazijnzuur (CaNa2EDTA of EDTA), dat intraveneus werd toegediend. De stabiliteitsconstanten van aluminium en andere metalen van biochemisch belang met verschillende chelaatvormers, waaronder EDTA, zijn eerder bestudeerd. De ontwikkeling van een reeks metaalcomplexconstanten diende om chemische en functionele eigenschappen van de metalen te correleren en suggereerde dat EDTA in staat was aluminium te mobiliseren.
In het verleden zijn toxische niveaus van Al geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten (ND). Er is gewezen op een mogelijk verband tussen Al en de ziekte van Alzheimer. In 1991 werd gemeld dat behandeling met een lage dosis intramusculair desferrioxamine (DFO), een driewaardige chelator die overmatig ijzer en/of aluminium uit het lichaam kan verwijderen, de progressie van de ziekte van Alzheimer vertraagt.
In het huidige werk hebben wij besloten te bestuderen of Al betrokken was bij neurotoxiciteit. Wij evalueerden de Al lichaamsbelasting bij patiënten die al dan niet aan ND leden. Wij onderzochten ook de mogelijke vermindering van deze belasting na behandelingen met de chelaatvormer EDTA.
2. Materialen en Methoden
2.1. Study Design and Patient Recruitment
Uit 471 opeenvolgende proefpersonen die een medische controle hadden ondergaan in een poliklinisch medisch centrum, werden slechts 211 geselecteerd en ingeschreven voor deze studie vanwege bewijs van hun Al last en therapietrouw in het volgen van het protocol, bijvoorbeeld het ontvangen van chelatietherapie eenmaal per week door persoonlijke keuze. De onderzochte ND in deze studie waren multiple sclerose (MS), amyotrofe laterale sclerose (ALS), ziekte van Parkinson (PD), en ziekte van Alzheimer (AD). Veel MS-patiënten waren eerder behandeld met conventionele geneesmiddelen die bij dergelijke pathologie worden gebruikt (bijv. immunosuppressiva, zoals mitoxantrone en azathioprine, breedspectrum immunomodulerende middelen, zoals glatirameeracetaat en interferon, en monoklonale antilichamen, zoals rituximab en natalizumab). Sommige MS-patiënten waren nog nooit eerder met geneesmiddelen behandeld. Er zijn ook patiënten gerekruteerd die niet aan bekende ziekten leden (gezonde proefpersonen of controles), alsmede patiënten die aan niet-neurodegeneratieve pathologieën leden (niet ND, waarmee ziekten worden bedoeld die niet als ND worden geclassificeerd, zoals fibromyalgie). Sommige gezonde patiënten die vroeger blootgesteld waren aan toxische metalen in het milieu of op het werk, verkozen hun mogelijke intoxicatie te onderzoeken door de aanwezigheid van dergelijke metalen in haarstalen te evalueren. Zij werden dan ook uitgesloten van deze studie. Alle patiënten gaven geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie. Zij waren tussen 18 en 75 jaar oud.
2.2. Chelatietest en evaluatie van Urine Al
Patiënten werden onderworpen aan de chelatietest om mogelijke Al-intoxicatie aan te tonen. Zij werden namelijk uitgenodigd om urinemonsters te verzamelen voor en na de intraveneuze behandeling met de chelaatvormer EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur, b.v. calciumdinatriumedetaat, 2 g/10 ml verdund in 500 ml fysiologische zoutoplossing, Farmax srl, Brescia, Italië). EDTA werd intraveneus langzaam toegediend (de infusie duurde ongeveer 2 uur) aan de patiënten. Na de chelatie werd de urine gedurende 12 uur verzameld. De monsters werden nauwkeurig in steriele flesjes gedaan en vervoerd naar het laboratorium voor toxicologie (Doctor’s Data Inc., St. Charles, IL, USA), waar ze werden verwerkt. De monsters werden met zuur ontsloten met gecertificeerde metaalvrije zuren; de ontsluiting vond plaats in een microgolfontsluitingssysteem met gesloten vat. Voor monsterverdunning werd ultrapuur water gebruikt.
Om verontreiniging te voorkomen, werden alleen plastic materialen gebruikt. Al het laboratoriummateriaal (pipettips, maatkolven, enz.) werd gedurende ten minste 48 uur ondergedompeld in een 10% (v/v) HNO3/ethanol-oplossing en kort voor gebruik gewassen met Milli-Q gezuiverd water. Om verontreiniging door de lucht te voorkomen, werden alle stappen in de bereiding van monsters en reagentia uitgevoerd op een schone bank van klasse 100.
De tests werden uitgevoerd via inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS) waarbij gebruik werd gemaakt van botsings/reactiecelmethoden, gekoppeld aan ion-moleculechemie, een nieuwe betrouwbare methode voor interferentievermindering. De methode is onlangs gebruikt voor de biomonitoring van 20 sporenelementen in bloed en urine van beroepsmatig blootgestelde werknemers. Gecertificeerde urinestandaarden en interne standaarden werden gebruikt voor kwaliteitscontrole en om de resultaten te valideren. Om de potentieel grote foutmarge als gevolg van vochtinname en monstervolume te vermijden, werden de resultaten gerapporteerd in microgrammen (μg) per g creatinine. Creatinine werd gemeten door middel van omgekeerde-fase hogedrukvloeistofchromatografie en werd gebruikt om het totale volume van het urineAl te corrigeren voor verschillen in de glomerulaire filtratiesnelheid van de individuen op het moment van de spotmonsters. Het onderzoeksprogramma getiteld “Effecten van chelatietherapie met EDTA bij patiënten die lijden aan pathologieën die verband houden met blootstelling (acuut of chronisch) aan toxische metalen” is goedgekeurd door de ethische commissie van de universiteit van Milaan (Italië) (nummer 64/2014).
2.3. Clinical Evaluation of Patient’s Symptom Improvement in MS
Bij gebrek aan een diagnostische test specifiek voor MS, heeft de neurologische gemeenschap diagnostische criteria aangenomen die werden vervangen in de tijd . Magnetic resonance imaging (MRI), analyse van cerebrospinale vloeistof, en visuele evoked potential, toegevoegd aan de klinische diagnose, werden beschouwd als beperkingen van sensitiviteit en specificiteit. Successievelijk heeft MRI aan belang gewonnen. De diagnose van verbetering van de symptomen van de patiënt is momenteel echter gebaseerd op klinische criteria, zoals vermindering van neurologische invaliditeit (paresthesie, loopataxie, spasticiteit, neuritis optica en blaasfunctiestoornissen) en vermoeidheid. Soms gaan de symptomen van ALS, zoals parese, spieratrofie en dysarthrie, gepaard met MRI- en cerebrospinale vloeistofafwijkingen die typisch zijn voor MS. Inderdaad, wij hebben de verbetering van de symptomen van de patiënt beschouwd als het herstel van klinische invaliditeit, bijvoorbeeld het vermogen om te werken, vermindering van spasticiteit, uitstel van terugval, en/of verdwijnen van vermoeidheid.
2.4. Effect van EDTA chelatietherapie op Al-intoxicatie
Patiënten bij wie Al-intoxicatie werd aangetoond (door onderzoek van het Al-gehalte in urinemonsters) werden onderworpen aan EDTA chelatietherapie. EDTA (2 g in 500 ml fysiologische zoutoplossing) werd bij elke patiënt in ongeveer 2 uur intraveneus toegediend. De behandeling werd eenmaal per week gegeven en duurde tien weken. Aan het einde van de behandelingen werden de urine Al niveaus geanalyseerd, zoals eerder beschreven.
2.5. Data-analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Microsoft Excel 2010 en IBM SPSS Statistics 20 (IBM Armonk, New York, USA). Een logistische regressieanalyse werd gebruikt om de relatieve bijdragen van verschillende variabelen aan de operatie-uitkomsten te onderzoeken. werd als significant beschouwd.
3. Resultaten
3.1. Kenmerken van de patiënten
Figuur 1 rapporteert de verdeling van de patiënten die Al intoxicatie vertoonden.
Schema van de kenmerken van de ingeschreven proefpersonen.
De meest vertegenwoordigde patiënten getroffen door ND waren die met MS (85,6% van het totaal ND). We hebben zowel de groep MS-patiënten als de groep ND-patiënten vergeleken met de groep gezonde patiënten.
3.2. Al Intoxication
Alle patiënten vertoonden geen Al intoxicatie vóór EDTA challenge (gegevens niet getoond). Alle patiënten getroffen door ND vertoonden intoxicatie door verschillende toxische metalen (data niet getoond). Na challenge met EDTA was Al aanwezig in 44.8% van alle gevallen van ND en gezonde patiënten. De niveaus van Al-intoxicatie, zoals verkregen uit de evaluatie van het μg/g creatininegehalte van Al in de urinemonsters verzameld na de eerste intraveneuze behandeling met EDTA (chelatietest), worden gerapporteerd in Figuur 2. Uit de gegevens blijkt dat de Al-waarden significant hoger waren in de urinemonsters van SM- en ND-patiënten dan in die van gezonde patiënten.
Aluminium (Al) niveaus geëvalueerd in de urinemonsters van onderzochte proefpersonen, na chelatietest (donker) en na tien chelatietherapieën met EDTA (licht), uitgedrukt als gemiddelde ± SEM van μg/g creatinine. De onderzochte proefpersonen waren gezonde patiënten, patiënten met multiple sclerose (MS) en patiënten met alle neurodegeneratieve ziekten (ND). De niveaus van Al in zowel MS als ND patiënten waren significant hoger in vergelijking met die verkregen bij gezonde proefpersonen na chelatietesten (versus gezond). Na chelatietherapie met EDTA waren de niveaus van Al significant lager dan die verkregen na chelatietest (# versus en ## versus ).
3.3. Nut van EDTA chelatietherapie
Het effect van EDTA chelatietherapie wordt ook gerapporteerd in figuur 2. De patiënten die na een chelatietest een Al-intoxicatie vertoonden, ondergingen namelijk chelatietherapie (intraveneuze toediening van EDTA, eenmaal per week). Na tien therapieën werden de Al-niveaus in de urinemonsters verder geëvalueerd en vergeleken met de niveaus die na de chelatietest werden verkregen. EDTA toediening bleek significant efficiënt te zijn in het verwijderen van de Al belasting, zoals te zien is in figuur 2. Onze resultaten toonden aan dat vermindering van de tijd van Al-intoxicatie goed samenhing met verbeterde klinische condities van de patiënten. In feite presenteerden zij, in verschillende mate, vermindering van neurologische invaliditeit en vermoeidheid.
Natuurlijk was de werkzaamheid van EDTA chelatietherapie duidelijker bij ND dan bij gezonde patiënten.
4. Discussie
Toxische metalen, pesticiden, en fenolen worden beschouwd als belangrijke milieuverontreinigende stoffen. Giftige metalen worden geclassificeerd als niet biologisch afbreekbare stoffen, evenals kunststoffen en detergenten, omdat ze niet door micro-organismen worden afgebroken. Zij vormen een wereldwijd gezondheidsrisico omdat zij kunnen bijdragen tot een verscheidenheid van ziekten. In dit verband is Al (een zeer reactief element en alomtegenwoordige milieuverontreiniging) in verband gebracht met een aantal ziekten. Zo is osteomalacie een skeletaandoening die verband houdt met toxische effecten van Al, zoals fosfaattekort, verminderde Ca-opname en disfunctionele proliferatie van osteoblasten. Bovendien kan de blootstelling aan Al de opname van Fe in de darmen belemmeren, waardoor bloedarmoede wordt bevorderd. Bovendien kan Al een actieve rol spelen in de pathogenetische mechanismen van neurologische ziekten. Met name is aangetoond dat Al verantwoordelijk is voor kritieke neuropathologische laesies in de ziekte van Alzheimer en andere verwante aandoeningen vanwege zijn vermogen om hypergefosforyleerde eiwitten te cross-linking . Al is aangetroffen in amyloïde vezels in de kernen van seniele plaques in de hersenen van AD-patiënten. De aanwezigheid van Al in biologische systemen zou kunnen leiden tot een belangrijke prooxidant activiteit, door het bevorderen van superoxide generatie via Fenton reactie . Meer recent is voorgesteld om Al bij AD patiënten te verwijderen door behandeling met DFO. Succesvolle behandeling met DFO (zowel in lage als in standaarddosis) is uitgevoerd voor Al overbelasting bij hemodialysepatiënten. Bovendien is aangetoond dat DFO in staat is om beschermende effecten uit te oefenen in het hersenweefsel van muizen tegen door Al veroorzaakte structurele en metabolische veranderingen. Omdat sommige patiënten echter intolerant kunnen zijn voor DFO of bijwerkingen van DFO kunnen ontwikkelen zoals allergische reacties, neurologische symptomen, of duidelijke gastro-intestinale onrust, besloten wij EDTA als chelaatvormer te gebruiken. Van de chelator N-(2-hydroxyethyl) ethyleendiamine triazijnzuur (HEDTA), vergelijkbaar met EDTA, is aangetoond dat het efficiënt is, ook in combinatie met selenium, tegen Al-geïnduceerde oxidatieve stress in rattenhersenen.
Een verhoogde urinaire uitscheiding van Al en Fe is eerder aangetoond bij MS-patiënten.
Wij hebben eerder het geval bestudeerd van een jonge man die aan MS leed, en die al enkele jaren zonder succes werd behandeld met de huidige therapieën. Symptomen die door de patiënt werden onthuld waren subacuut gezichtsverlies, diplopie, en pijn bij oogbewegingen als de eerste symptomen van optische neuritis; verstoring van de fijne motoriek; paresthesie en loopataxie; blaasfunctiestoornissen; en aanzienlijke vermoeidheid. Wij onderzochten zijn niveaus van toxische metalen in de urine, na intraveneuze “challenge” met EDTA. De patiënt vertoonde verhoogde niveaus van Al, Pb, en Hg in de urine. Hij werd inderdaad tweemaal per maand onderworpen aan een behandeling met EDTA. Onder behandeling vertoonde de patiënt na verloop van tijd verbeterde symptomen die wijzen op een MS-remissie. Hij kreeg zijn gezichtsvermogen en zijn blaasfunctie terug en de paresthesie en de vermoeidheid verdwenen. Omdat het meest vertegenwoordigde toxische metaal bij deze patiënt Al was, besloten we de mogelijke relatie van Al-intoxicatie met ND te onderzoeken.
Onze resultaten tonen aan dat Al-niveaus gemeten in urinemonsters van patiënten die zowel aan MS afzonderlijk als aan de totale ND leden, significant hoger waren dan die van gezonde patiënten, zoals gerapporteerd in figuur 2. Gezonde patiënten vertoonden ongeveer 80 μg/g creatinine, als gemiddelde Al niveaus, zelfs als de normale waarden 35 μg/g creatinine zijn. Deze gegevens suggereren dat Al-intoxicatie niet noodzakelijk gerelateerd is aan het begin van de klinische symptomen van ND. Bovendien zijn controle patiënten mogelijk in staat om verdere Al belasting te beperken door neuroprotectieve of anti-oxidant mechanismen die afwezig zijn bij ND patiënten. Klinische evaluaties van elke patiënt suggereerden de aanwezigheid van een belangrijke relatie tussen Al-intoxicatie en bewegingsstoornissen, paresthesie, ataxie en andere symptomen die door ND-patiënten worden vertoond. De patiënten die maximale waarden van Al in het urinemonster vertoonden, vertoonden inderdaad ook de ernstigste ziekteverschijnselen op klinisch niveau. Het bezwaar dat het mobiliseren (door chelatiemiddelen) van Al uit relatief veilige plaatsen zoals bot en het afzetten van dit zeer neurotoxische metaal in het CZS gevaarlijk kan zijn, wordt tegengesproken door de overweging dat patiënten met ND vóór de chelatie last hadden van Al (dat verantwoordelijk is voor de pathogenese van de ziekte) in het CZS. Bovendien worden de complexen gevormd door toxische metalen met chelaatvormers goed verwijderd door de nieren. Recente studies toonden aan dat ernstige gedragsstoornissen van de motoriek en verlies van de motorische neuronen in het zenuwstelsel optraden wanneer een Al-vaccin adjuvans werd toegediend aan een diermodel. Muizen die met Al-hydroxide werden geïnjecteerd vertoonden inderdaad een aanzienlijke toename van de celdood in het ruggenmerg en de motorische cortex, waarbij vooral de motorische neuronen werden aangetast en neuro-inflammatie werd geïnduceerd. De effecten leken sterk op de schade die bij de mens wordt waargenomen bij ALS.
Zoals onlangs gerapporteerd, blijkt het immuunsysteem ook gevoelig te zijn voor blootstelling aan Al. Effecten van Al op auto-immuniteit, orale tolerantie, CD4+ en CD8+ expressie, overgevoeligheid, en erytrocyten immuunfunctie wijzen op zijn immunotoxische activiteit. Er is gesuggereerd dat veel van de kenmerken van Al-geïnduceerde neurotoxiciteit gedeeltelijk het gevolg kunnen zijn van auto-immuunreacties.
Ten slotte wordt in een recent rapport van Exley C Al beschouwd als een potentiële bijdrage tot het ontstaan, de progressie en de agressiviteit van ND, ook al lijkt het moeilijk vast te stellen wanneer het bijdraagt tot de etiologie van de ziekte. Aangezien Al echter een risico vormt voor de gezondheid van de mens, is het noodzakelijk maatregelen te nemen om de belasting van het lichaam tot de laagst mogelijke praktische grens te beperken.
Welke strategie kan worden voorgesteld voor de gemeenschappelijke therapie van door toxische metalen veroorzaakte schade? Intracellulaire opname van toxische metalen zou adequaat worden voorkomen door relevante remmers (chelators), terwijl de ROS generatie en ROS-gemedieerde processen zouden worden voorkomen of verbeterd door relevante antioxidanten en wegvangers van vrije radicalen en Fe.
In onze ervaring, zoals aangetoond in eerdere studies en in de huidige, heeft verwijdering van toxische metalen gunstige effecten geïnduceerd door verbetering van de symptomen van de patiënt . Er werden geen nadelige effecten waargenomen van EDTA behandelingen. Metaalverwijdering bleek geleidelijk in de tijd, en suggereerde vele chelatietherapieën. Concluderend, in de huidige studie tonen we aan dat EDTA chelatietherapie in staat was om de Al last te verminderen bij patiënten die getroffen waren door ND door hun klinische condities te verbeteren. We hopen dat in de toekomst een dergelijke behandeling zal worden beschouwd als een nuttig instrument om de symptomen van ND patiënten te verbeteren.
Conflict of Interests
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.