4.3 From lens vesicle to the mature lens
De lens vesicle vormt zich door het sluiten van de lens cup (ook bekend als lens pit) en zich los te maken van het oppervlakte ectoderm. Een tussenstap is de ontwikkeling van een lenssteel die het gesloten blaasje en het oppervlakte-ecdoderm gedurende enkele uren bij elkaar houdt (bij de muis). Het lensblaasje is bijna bolvormig met een grote centrale holte; de cellen van de achterste pool rekken uit tot zij de voorste epitheelcellen bereiken en het hele lensblaasje vullen; deze langgerekte cellen worden primaire lensvezelcellen genoemd. Deze stap vindt plaats rond dag 44 van de dracht bij menselijke embryo’s en op E11,5 bij de muis (Fig. 10.5). De cellen aan de voorste pool van het lensblaasje blijven als epitheelcellen bestaan. Mitotisch actieve cellen rond het centrale gebied van het lensepitheel bewegen naar het equatoriale gebied (of het booggebied van de lens), waar ze zich uitstrekken en differentiëren tot secundaire lensvezels. De middellijn, waar secundaire lensvezels van tegenovergestelde punten van de evenaar samenkomen, wordt de anterieure en posterieure lensnaad genoemd. De secundaire lensvezels vormen concentrische lagen rond de primaire vezels van de lenskern (bij de muis op dag E15,5; Fig. 10.5). Met deze opstelling zijn de lensvezels naar de periferie toe successievelijk jonger in termen van ontwikkeling en differentiatie. Zolang de lens groeit, schuiven nieuwe secundaire vezels vanaf de evenaar de buitenste cortex van de lens binnen.
Figuur 10.5. Vorming van de lens. Zodra het lensblaasje is gevormd, strekken de primaire lensvezels zich uit het achterste epitheel van het lensblaasje en vullen het volledige lumen. De secundaire vezelcellen beginnen zich uit te strekken ter hoogte van de boog van de lens; de vezels van tegenovergestelde zijden komen samen ter hoogte van de voorste en achterste pool en vormen de lensnaden (die in driedimensionaal beeld Y-vormig zijn). De laatste stap in de differentiatie van de lens is de afbraak van de celkernen en mitochondriën, die bij de muis rond de geboorte plaatsvindt (gewijzigd volgens Graw, 2003; met toestemming van de Nature Publishing Group).
Zowel de primaire als de secundaire vezelcellen verliezen hun mitochondriën en celkernen tijdens het uiteindelijke differentiatieproces: voor de primaire vezels vindt dit bij muizen plaats op E17/E18 en is het 2 weken na de geboorte voltooid, wanneer de muizen hun oogleden openen (Vrensen et al., 1991). De secundaire vezelcellen, die de primaire vezelcellen omsluiten, verliezen hun organellen, wanneer zij van de buitenste naar de binnenste cortex verhuizen (Kuwabara en Imaizumi, 1974).
De voorste epitheelcellen blijven echter mitotisch actief als een stamcel niche die secundaire vezelcellen produceert. Deze secundaire lensvezelcellen zijn terminaal gedifferentieerde cellen en verliezen ook hun organellen, wanneer zij dieper in de lens worden gedrukt door de opeenvolgende vezelcellen.
In de zebravis treden echter verscheidene verschillen op in de ontwikkeling en differentiatie van de lens. In het bijzonder vindt de primaire rek van de vezelcellen plaats op een cirkelvormige wijze, wat resulteert in een embryonale lenskern met concentrische schillen van vezels. De zeer nauwe afstand tussen de kernen van de differentiërende secundaire vezels in een smalle zone dicht bij het equatoriale epitheel, suggereert echter dat de differentiatie van secundaire vezelcellen afwijkt van die beschreven voor zoogdier- of vogellenzen. Vanwege deze verschillen moet men voorzichtig zijn met het extrapoleren van bevindingen over de zebravis naar de ontwikkeling of functie van de menselijke of muislens (Dahm et al., 2007).
In muizen karakteriseren ten minste twee genen, Pitx3 en Foxe3, het belang van de voorbijgaande aard van het stadium van de lenssteel. In muizenembryo’s komt Pitx3 tot expressie in de ontwikkelende lens vanaf E11, eerst in het lensblaasje, en later in het voorste epitheel en de evenaar van de lens. Mutaties in de regulerende of coderende regio’s van het Pitx3-gen blijken het fenotype van afakie (ak) of oogloze (eyl) muismutanten te veroorzaken, waarbij lenzen en pupillen ontbreken (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). Bij deze muizen blijft de lenssteel enkele dagen bestaan, wat uiteindelijk leidt tot een afbraak van het rudimentaire lensblaasje, en netvliesweefsel vult de gehele oogbol. Aangezien Pitx3 ook tot expressie komt in dopaminerge neuronen van de substantia nigra, zijn deze muizen ook uitstekende modellen voor de ziekte van Parkinson (Rosemann et al., 2010). In tegenstelling tot de muis veroorzaken mutaties in het humane PITX3 voorste segment mesenchymale dysgenese (ASMD; Semina et al., 1998).
De ak/ak muizen hebben een oculair fenotype dat sterk lijkt op dat van de dyl (dysgene lens) muizen, wat erop wijst dat beide genen betrokken zijn bij hetzelfde biologische proces. Blixt et al. (2000) toonden aan dat het dyl fenotype gemedieerd wordt door een mutatie in het Foxe3 gen. Bij de muis komt FoxE3 tot expressie in het zich ontwikkelende oog rond E9,5, bij het begin van de inductie van de lensplacode (Fig. 10.2). Naarmate de lens placode zich vormt, neemt de expressie van FoxE3 toe en wordt deze beperkt tot het lensblaasje, dat zich losmaakt van het ectoderm aan de oppervlakte. Bij dyl-muizen zijn twee mutaties binnen het DNA-bindende domein van FoxE3 gevonden. Bij de mens zijn mutaties in FOXE3 verantwoordelijk voor anterior segment optical dysgenesis (ASOD). Vanwege het expressiepatroon van FOXE3 en het variabele fenotype van de heterozygote dyl muizen, werd een klein cohort van patiënten met Peters anomalie bij wie geen PAX6 mutaties konden worden aangetoond, gescreend op FOXE3 mutaties. Een van de patiënten bleek heterozygoot te zijn voor een Arg90Leu substitutie die het DNA-bindende domein van FOXE3 beïnvloedt (Ormestad et al., 2002).
De tweede belangrijke stap is de verlenging van de cellen aan de achterste helft van het lensblaasje, waardoor dit gevuld wordt met primaire vezelcellen. In de muismutant “opaque flecks in the lens” tast een puntmutatie de basisregio van Maf aan (gecodeerd door een oncogen, verantwoordelijk voor musculoaponeurotisch fibrosarcoom) en verhindert de correcte vorming van de primaire lensvezels, wat leidt tot een fenotype dat lijkt op de pulverulente cataract in een menselijke familie (Lyon et al., 2003). MAF bij zoogdieren komt tot expressie in de lensplacode en de lensblaasjes, en later in de primaire lensvezels.
Op vergelijkbare wijze karakteriseerden Puk et al. (2008) onlangs een nieuwe ethyl nitroso-urea (ENU)-geïnduceerde muismutant met een klein-oog fenotype en een leeg lensblaasje in de homozygote toestand. In dit geval werd een mutatie in het gen Gjf1 (ook wel Gje1 genoemd) geïdentificeerd. Bij de muis codeert het gen Gjf1 voor een connexine-achtig eiwit van 23,8 kDa, dat tot expressie komt in het achterste deel van het lensblaasje, waar de primaire vezelverlenging begint. In de mutanten is het expressiepatroon van Pax6, Prox1, Six3, en Crygd gewijzigd, maar niet dat van Pax2. Het gen Gjf1 wordt verondersteld essentieel te zijn voor de vorming van de primaire lensvezels (Puk et al., 2008) en zou beschouwd kunnen worden als een stroomafwaarts doelwit van de transcriptiefactor c-Maf; mutaties in het corresponderende Maf gen leiden tot een soortgelijk fenotype in de muis (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). Op dit moment is het niet duidelijk of er een functionele menselijke tegenhanger is van het muis Gjf1 gen.
Een derde fenotype zonder elongatie van de primaire lensvezels wordt veroorzaakt door de knockout van het Pparbp gen (coderend voor het peroxisome proliferator activator receptor binding protein; Crawford et al., 2002). De relatie tussen deze drie functioneel verschillende eiwitten voor de vorming van de primaire lensvezel cellen is nog niet duidelijk.
Naast deze drie genen, zou Wnt signalering ook een rol kunnen spelen in de rek van de primaire vezelcellen. Faber et al. rapporteerden in 2002 een dominant-negatieve vorm van de Bmp-receptor 1b (gen symbool: Bmpr1b) in transgene muizen. Deze transgene muismutanten vertonen een remming van de ontwikkeling van de primaire vezelcellen, echter op een asymmetrische wijze: het verscheen alleen aan de nasale zijde van de lens in de ventrale helft. De auteurs concluderen dat verschillende differentiatie stimuli actief zouden kunnen zijn in verschillende kwadranten.
Aan de voorzijde blijven de lens epitheel cellen de enige mitotisch actieve cellen in de lens. Zij worden gekenmerkt door een voortdurende expressie van verscheidene Wnt genen: de gedetailleerde expressiegegevens die zijn gerapporteerd, verschillen echter niet alleen tussen kuikens en muizen, maar variëren ook tussen verschillende muizenstammen (voor details, zie een review door de Iongh et al., 2006). Niettemin blijft het duidelijk dat Wnt signaalweg genen voornamelijk tot expressie komen in de lens epitheel cellen. Consequent is ook aangetoond dat Fzd receptoren (gensymbolen: Fzd1-8) en co-receptoren Lrp5 en Lrp6, Sfrp1-3 en Dkk1-3 genen tot expressie komen tijdens de ontwikkeling van de lens. Zij zijn vooral aanwezig in de epitheelcellen; de enige uitzondering is Fzd6 dat in toenemende mate tot expressie komt in differentiërende vezelcellen (de Iongh et al., 2006). Als voorbeeld zijn lrp6 null mutanten geanalyseerd die (naast enkele andere defecten; zie MGI database) kleine ogen en afwijkende lenzen vertonen, gekenmerkt door een onvolledig gevormd voorste epitheel, resulterend in extrusie van lensvezels in het bovenliggende hoornvlies stroma (Stump et al., 2003).
Het belangrijkste signaal voor de differentiatie van lensvezelcellen is echter Fgf signalering. Een van de meest significante bevindingen toonde in ratten lens explanten aan dat verschillende concentraties van Fgf2 (voorheen bekend als “basic Fgf” of “bFGF”) verantwoordelijk zijn voor lenscel proliferatie, migratie, en lensvezel celdifferentiatie (McAvoy and Chamberlain, 1989). Omdat het nog onbekend is welke van de verschillende Fgf’s betrokken zijn bij de inductie van de lens (Smith et al., 2010), heeft het onderzoek zich gericht op de Fgf-receptoren. Zoals hierboven vermeld, traden ernstige defecten in de verlenging van de lensvezelcellen op in lenzen waarin drie Fgf receptor genen ontbraken (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008). Fgf signalering is ook noodzakelijk voor het primen van de niet-canonieke Wnt pathway (d.w.z, onafhankelijk van β-catenine) in lens epitheliale cellen; in lens explantanten, leidt het tot accumulatie van β-crystalline, een marker voor vezel celdifferentiatie (Lyo en Joo, 2004).
De volgroeide lens bevat verschillende klassen van structurele eiwitten: de kristallijnen (α-, β-, γ-, δ-, μ-, ζ-kristallijnen), transmembraaneiwitten (zoals MP19 en MIP26, en de connexines 43, 46, en 50), sommige collagenen, en cytoskelet- en intermediaire filament-eiwitten. Mutaties in de corresponderende genen (of specifieke transcriptiefactoren) leiden tot functionele onevenwichtigheden en lens troebelheid (cataract). De leeftijd waarop de cataract optreedt en de wijze van overerving hangen af van de expressie van de corresponderende genen en van het domein dat door de onderliggende mutatie is aangetast. In totaal zijn er ∼60 verschillende genen bekend die verantwoordelijk zijn voor cataractvorming bij muizen en mensen. Een gedetailleerde bespreking van de corresponderende mutaties en hun functionele consequenties valt buiten het bestek van dit hoofdstuk; reviews over dit specifieke onderwerp zijn recent door de auteur gepubliceerd (Graw, 2009a,b).