May 12, 2018
Een veel voorkomende vraag die wetenschappers altijd stellen wanneer ze het signaal krijgen van een op antilichamen gebaseerde assay is: “Geeft dit signaltruly de aanwezigheid en hoeveelheid van mijn eiwit weer?”
Antilichaamspecificiteit is altijd een zorg voor wetenschappers. Hoewel er een aantal validatiemethoden zijn gebruikt voor het testen van de specificiteit, worden de gegevens vaak overgeïnterpreteerd. Onderzoeksgegevens van verschillende groepen hebben aangetoond dat sommige veelgebruikte monoklonale antilichamen op de markt in feite niet monospecifiek zijn. En de kruisreactiviteit kan onderzoekers misleiden met vals-positieve resultaten, en mogelijk onverwachte bijwerkingen en valse diagnoserapporten voor clinici veroorzaken.
Welke controles moeten we gebruiken voor de validatie van de specificiteit van antilichamen?
Cellijnen en weefsels die de doeleiwitten in hoge hoeveelheden tot expressie brengen, kunnen worden gebruikt als positieve controles voor de validatie van antilichamen. Het kan gaan om endogeen eiwit of om gedexpresseerd eiwit dat wordt gecodeerd door een cDNA-kloon. Een positieve controle kan echter niet de specificiteit van het antilichaam bevestigen. U kunt een band met de juiste grootte of een positieve kleuring op de juiste subcellulaire plaats zien, maar dit kunnen allemaal vals-positieve signalen zijn van de kruisreactiviteit van het antilichaam. Dus normaal voor antilichaam validatie, is een negatieve controle nodig voor de beoordeling van niet-specifieke binding.
Knockout validatie is tot nu toe de beste negatieve controle voor de beoordeling van antilichaam specificiteit. Bij knock-outvalidatie wordt het antilichaam getest op een knock-outcellijn die het doeleiwit niet tot expressie brengt. Vanaf 2017 werkt OriGene samen met EdiGene, een CRISPR-innovator, om op een high-throughput manier dubbele knock-outcellen te produceren. In tegenstelling tot de knock-out cellijn van Horizon, zijn de OriGene knock-out cellijnen afkomstig van de meest gebruikte cellijnen, zoals HEK293T of HeLa, waardoor het product relevanter is voor onderzoekers.In deze dubbele knock-out cellijn is het antilichaamdoelwit niet aanwezig omdat het gen dat codeert voor het eiwit is geëlimineerd of “knock-out” is gemaakt. Monsters van knock-outcellen en oudercellen (wild type) worden naast elkaar getest met hetzelfde antilichaam, en als het antilichaam echt specifiek is, zou het alleen het specifieke signaal in wild type-cellen moeten detecteren, maar niet in de knock-outcellijn. Met behulp van de lysaten van deze knock-outcellen hebben wij meer dan 100 monoklonale antilichamen gevalideerd (KO gevalideerde antilichamen). Aangenomen wordt dat knockout-validatie een echte negatieve controle biedt voor het testen van de specificiteit van antilichamen.
Maar is knockout-validatie voldoende om de monospecificiteit van een antilichaam te bevestigen? Ik zou voorzichtig zijn met deze conclusie. Ten eerste zijn de off-target-effecten van knock-outcellen in dit stadium nog niet goed bestudeerd. Het is dus mogelijk dat een knock-outcel niet alleen de expressie van uw belangwekkend eiwit elimineert, maar ook de expressie van een ander eiwit elimineert of vermindert, dat een eiwit kan zijn dat kruisreageert met het antilichaam. Het negatieve signaal betekent dus niet altijd dat het antilichaam met geen enkel ander eiwit zal reageren dan met het eiwit van uw interesse. Ten tweede, testen met knock-out cellen/weefsel is alleen mogelijk voor de niet-essentiële eiwitten. Voor de essentiële eiwitten is knock-out onmogelijk. Voor deze proteïnen hebt u dus een andere manier nodig om de specificiteit van het antilichaam te testen.
Enkele jaren geleden ontwikkelde OriGene een proteïne-array-methode voor het testen van de specificiteit van antilichamen. Met ’s werelds grootste verzameling van overexpressie lysaten, hebben we een unieke eiwitchip gemaakt die >10k overgeëxpresseerde menselijke eiwitten in duplo bevat op een enkel nitrocellulose gecoat glasplaatje. Deze proteïne-microarray-technologie is gebruikt om de specificiteit van vele OriGeneUltraMAB™ monoklonale antilichamen te valideren. Door het aantal eiwitten op de chip te verhogen, kan de kruisreactiviteit van een antilichaam verder worden bestudeerd in het gehele menselijke proteasoom.
Samengevat is het testen van de specificiteit van antilichamen vrij gecompliceerd. Het moet worden gevalideerd door meerdere tools en richtingen.Als de technologie blijft vooruitgaan, zullen we meer waardevolle middelen en gestandaardiseerde procedures voor antilichaam validatie.Wetenschappers zullen niet worden geconfronteerd met dezelfde vraag wanneer ze positieve signalen van hun antilichaam gebaseerde assays.