Antiglycemisch effect van met water extraheerbare Arabinoxylan uit tarwe aleuron en zemelen

Abstract

De studies naar de effecten van arabinoxylan (AX) polysacchariden op de postprandiale glucose respons hebben geleid tot contrasterende resultaten als gevolg van de diversiteit in AX structuren. Vier met water extraheerbare AX (WEAX) extracten, verkregen uit tarwe aleuron en zemelen, zijn gebruikt om (a) het effect van AX op de activiteiten van α-amylase en α-glucosidase te onderzoeken, (b) de invloed van de chemische samenstelling van AX op hun remmingspotentie, en (c) de kinetiek van enzyminhibitie. De α-amylaseactiviteit werd niet significant beïnvloed door de aanwezigheid van WEAX-fracties, ongeacht type of concentratie. WEAX remde de α-glucosidase-activiteit alleen wanneer maltose als substraat werd gebruikt, maar niet sucrose. De IC50-waarden van WEAX (- mg/mL) waren sterk gecorreleerd met het ferulinezuurgehalte (), de verhouding arabinose/xylose (), en de relatieve verhoudingen van xylose die ongesubstitueerd (), gedesubstitueerd () en monosubstitueerd () is. De Lineweaver-Burk plot suggereerde een niet-competitieve remmingsmodus van het enzym. Onze resultaten suggereren dus dat de antiglycemische eigenschappen van WEAX afgeleid kunnen zijn van directe remming van de α-glucosidase activiteit.

1. Inleiding

De prevalentie van diabetes type 2 neemt wereldwijd toe. Diabetes is een chronische ziekte die wordt gekenmerkt door een hoge circulerende plasmaglucose. Daarom is het beheer van postprandiale glucose van cruciaal belang bij de preventie en behandeling van type 2-diabetespatiënten. Interventiestudies bij mensen hebben aangetoond dat de consumptie van een dieet rijk aan arabinoxylan (AX) de postprandiale bloedglucosespiegels bij gezonde personen, personen met verminderde glucosetolerantie en diabetici verlaagt. Mohlig en collega’s vonden daarentegen geen effect op de glucoserespons wanneer gezonde mensen broodjes kregen waaraan AX was toegevoegd. Dierstudies hebben ook gemengde resultaten gemeld over het effect van AX-suppletie. De onderliggende mechanismen blijven onduidelijk, maar er wordt beweerd dat oplosbare vezels de viscositeit van het lumen verhogen en daardoor de absorptie van voedingsstoffen vertragen. De schijnbare viscositeit van AX-oplossingen wordt beïnvloed door de asymmetrische conformatie en het moleculaire gewicht van AX’s, alsmede door de polymeerconcentratie. Van deze drie factoren lijkt de concentratie van AX de viscositeit het meest te beïnvloeden. Het effect van AXs op de bloedglucose is dus dosisafhankelijk. De schijnbare viscositeit van de AX-oplossingen is ook afhankelijk van de afschuifspanning, zodat hogere afschuifspanning leidt tot afschuifverdunning, het gedrag dat kenmerkend is voor niet-Newtonse vloeistoffen. Recente studies suggereren dat het viscositeitseffect van AX kan worden gecompenseerd door een sterke darmperistaltiek.

De moleculaire structuur van AX is complex en heterogeen. AX’s bestaan uit de xylan backbone van () gekoppelde β-D-xylopyranosyl (Xylp) residuen met α-L-arabinofuranosyl (Araf) residuen gekoppeld aan de xylan backbone op C(O)-2 en C(O)-3 en/of op zowel C(O)-2 en C(O)-3 posities . Xylose-residuen kunnen ook worden gesubstitueerd door glucuronzuur- en/of methylglucuronzuurbindingen . Ferulinezuur- of cumarinezuurresiduen zijn op de C(O)-5-positie aan arabinoseresiduen gekoppeld . De verhouding tussen arabinose en xylose, het patroon van arabinosesubstitutie, de feruloyleringsgraad en het molecuulgewicht variëren sterk tussen en binnen graankorrels . Arabinoxylanen (AX) vormen het grootste deel van de voedingsvezels in graankorrels (60-70%) en hun gehalte varieert naar gelang van de bron of graanfractie. AX vertegenwoordigen 1,3-2,7% gewichtspercent van tarwe. Tarwe aleuron en pericarp bevatten respectievelijk 20 en 45% AX . Een groot deel van de AX’s in tarwe is onoplosbaar in water (70-86%).

Dieet verteerbare koolhydraten worden gehydrolyseerd tot de monomere suikers glucose of fructose voordat ze worden opgenomen in het maagdarmkanaal. Zetmeel wordt voornamelijk door speeksel- en pancreasamylase verteerd tot maltose en andere korte-keten koolhydraten. De resulterende (maltose, maltotriose, en α-limiet dextrinen) en sucrose worden verteerd tot glucose of fructose door de dunne darm borstelgrens α-glucosidases (maltase-glucoamylase en sucrase-isomaltase) . Bij de suikerabsorptie in de dunne darm zijn voornamelijk GLUT2, GLUT5 en SGLT1 transporters betrokken. Derhalve kan vermindering van postprandiale hyperglykemie worden bereikt door beperking van de intestinale koolhydraatvertering of -opname. Ondanks de enorme verschillen in structuur van AX rapporteren de meeste studies weinig of geen details over de samenstelling of structuur van de gebruikte AX, waardoor het moeilijk is de resultaten over het effect van AX op postprandiale bloedglucose te vergelijken. Er bestaan ook zeer weinig gegevens over het effect van gezuiverde, met water extraheerbare AX’s op de koolhydraatverteringsenzymen. In deze studie hebben we ons daarom gericht op het onderzoeken van (a) het effect van AX op de activiteiten van α-amylase en α-glucosidase, (b) de invloed van de chemische samenstelling van AX op hun remmingspotentie, en (c) de kinetiek van enzymremming.

2. Materialen en Methoden

2.1. Chemische stoffen en reagentia

Een commercieel tarwe-auleuron (Grainwise wheat aleurone) was een gift van Cargill Limited en Horizon Milling (Wichita, Kansas, VS). Het bestaat uit respectievelijk 4,5, 15,2, 7,4, en 2,5% lipide, eiwit, as, en zetmeel. Zemelen van harde wintertarwe werden plaatselijk aangekocht bij Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Canada). Het vocht-, as- en eiwitgehalte ervan werd geanalyseerd op respectievelijk 5,8, 5,3 en 11,1%. Ongemodificeerd tarwezetmeel, maltose, sacharose, acarbose, α-amylase uit varkenspancreas (EC 3.2.1.1, Type VI-B), amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) uit aspergillus, en intestinale acetonpoeders van ratten werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Ammoniumsulfaat, alle zuren en organische oplosmiddelen werden gekocht bij Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Canada). Maltose-, sucrose- en glucosebepalingskit (K-MASUG 08/13) werd gekocht bij Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Ierland). Alle gebruikte chemicaliën waren van analytische of HPLC-kwaliteit.

2.2. De endogene enzymen werden geïnactiveerd door tarwezemelen en tarwebloemmonsters (~200 g) gedurende 2 uur bij 85°C onder reflux te koken in 2 liter waterige ethanol (80%, v/v). Het supernatant werd weggegooid en het residu werd een nacht bij kamertemperatuur aan de lucht gedroogd in een zuurkast. Uit de aan de lucht gedroogde zemelen of aleuron (150 g) werden bij 45°C met water extraheerbare fracties geïsoleerd volgens de door Izydorczyk en Biliaderis beschreven methode. Het waterextract werd ontzwaveld met α-amylase (1821 U/L) en ontproteïniseerd met celiet en vollemelkaarde. Het gezuiverde materiaal werd gefractioneerd door middel van getrapte ammoniumsulfaat (AS) precipitatie en fracties werden verkregen bij 50 en 75% AS verzadiging. Het verzamelde materiaal werd gevriesdroogd nadat het gedurende 48 uur was gedialyseerd (membraan met een cut-off van 12 kDa). Met water extraheerbare fracties uit tarwe aleuron werden gelabeld (WA), gevolgd door de AS-concentratie waarbij ze werden verkregen (WA-f50 en WA-f75). Op dezelfde manier werden de verzamelde materialen uit tarwezemelen (WB) aangeduid als WB-f50 en WB-f75. De chemische en structurele beschrijvingen van de WEAX-fracties zijn opgenomen in tabel 1.

Wit aleuron Wit zemelen WA-f50 WA-f75 WB-f50 WB-f75 Totaal koolhydraatgehalte (% w/w) 76.0 ± 0.6 85.7 ± 1.0 54.6 ± 0.5 81.6 ± 1.3 Eiwitgehalte (% w/w) 8.7 ± 0.2 8.6 ± 0.2 16.9 ± 0.3 11.3 ± 0.3 Bèta-glucaangehalte (% w/w) 0.4 0,7 12,5 15,7 Arabinoxylangehalte (% w/w) 74.0 83,9 41,5 66,6 Arabinose/Xylose-verhouding 0,58 0,5 0,6 .44 0.85 0.56 Totaal ferulinezuurgehalte 26.01 ± 0.40 6.53 ± 0.20 16,78 ± 0,35 4,34 ± 0,11 Eronzuurgehalte (%) 0,04 ± 0,0 0,04 ± 0,0 0.05 ± 0.0 0.08 ± 0.0 0.10 ± 0.0 Gemiddeld molecuulgewicht (kDa) 551.0 677.0 643.0 468.0 Patroon van substitutie Unsub- Xylp (%) 61 70 45.1 63.8 Mono-Xylp bij C (O)-2 (%) 3.2 0.2 1.4 0.1 Mono-Xylp bij C (O)-3 (%) 16,8 15,9 23,4 16,4 Totaal mono-Xylp (%) 20.1 16.1 24.8 16.5 Di-Xylp (%) 19.0 14.0 30.1 19,8

Waarden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking (). Un-Xylp: niet-gesubstitueerde xylose-residuen, mono-Xylp: monosubstitueerde xylose-residuen, di-Xylp: O-2 en O-3 ontsubstitueerde xylose-residuen.WA-f50 en WA-f75: met water extraheerbare fracties uit WA verkregen bij respectievelijk 50 en 75% verzadiging met ammoniumsulfaat. WB-f50 en WB-f75: met water extraheerbare fracties uit WB, verkregen bij respectievelijk 50 en 75% verzadiging met ammoniumsulfaat.

Tabel 1

Chemische samenstelling en kenmerken van met water extraheerbaar arabinoxyaan uit tarwe-auleuron (WA) en tarwezemelen (WB).

2.3. Tarwezetmeel (300 mg) werd gesuspendeerd in 15 ml natriumfosfaatbuffer (pH 6,9, 0,1 M) met 1 mM calciumchloride en gedurende 15 minuten bij 95 °C gekookt. WEAX-fracties (40 mg) werden opgelost in 2 mL natriumfosfaatbuffer. Monsters werden verdund, zodat de eindconcentratie in het reactiemengsel was 0,0, 0,2, 0,3, en 0,5% (w / v). Gelijke volumes (200 pi) van zetmeel en WEAX (of controle) werden gemengd en vortexed. Zetmeelhydrolyse werd geïnitieerd door toevoeging van 70 pi varkens pancreas α-amylase (130 U/mL) en 40 pi schimmel amyloglucosidase (240 U/mL). De reactie werd na 30 minuten gestopt door verhitting bij 95 °C gedurende 5 minuten. Het mengsel werd onmiddellijk afgekoeld op ijs en gecentrifugeerd (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Duitsland). De supernatanten werden verzameld en op glucose geanalyseerd met behulp van de Megazyme glucosetestkit. Menselijke interventiestudies hebben de effectiviteit gerapporteerd van een AX-concentratie van 0,25 tot 0,70% en vandaar onze keuze van het concentratiebereik.

2.4. De α-glucosidase-remmingsmethode van Oki et al. werd met enkele aanpassingen gebruikt. Kort gezegd werd acetonpoeder uit de darmen van ratten (500 mg) gemengd met 10 ml natriumfosfaatbuffer (pH 6,9, 0,1 M) en gedurende 30 seconden (12 keer) met 15 seconden pauze in een ijsbad gesoneerd om warmteopbouw te voorkomen. Het mengsel werd later gecentrifugeerd bij 10000 bij 4°C gedurende 10 minuten. Het supernatant werd verzameld en gelabeld rat intestinale α-glucosidase. WEAX monsters (40 mg) werden opgelost in 2 mL natriumfosfaatbuffer (pH 6,9, 0,1 M). Vervolgens werd 50 μL rat intestinale α-glucosidase gemengd met 100 μL monster of buffer (controle) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Vijftig μl van 20 mM sucrose of 4 mM maltose werd toegevoegd en verder geïncubeerd gedurende 60 minuten (sucrose) of 30 minuten (maltose). De uiteindelijke concentratie van de WEAX-fractie was 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, en 0,0% (w/v). De enzymactiviteit werd gestopt door verhitting bij 95°C gedurende 10 minuten. Na centrifugatie bij 10000 gedurende 10 minuten werden de supernatanten verzameld voor glucoseanalyse met de Megazyme GOPOD glucosetestkit. Het remmingspercentage van alfaglucosidase (sucrase of maltase) werd berekend als . De IC50-waarde werd bepaald uit de plot van % α-glucosidase inhibitie tegen monsterconcentratie. Ter vergelijking werd ook remming van α-glucosidase in de darmen van ratten met acarbose (een bekende α-glucosidase inhibitor) uitgevoerd. Acarboseconcentraties van 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8, en 13 μg/mL werden gebruikt in plaats van monster.

2.5. Statistische Analyse

Alle analyses werden uitgevoerd in sextuplicaat (tenzij anders aangegeven) en alle statistieken werden berekend met behulp van een manier analyse van variantie (ANOVA) op een JMP 12 statistische software (SAS Institute Inc, Cary, NC). Steekproefgemiddelden werden vergeleken met behulp van de Tukey HSD-methode en significante verschillen werden bepaald bij . Correlaties tussen parameters werden berekend met behulp van Pearson’s correlatietest.

3. Resultaten en Discussie

De effecten van WEAX op zetmeelhydrolyse worden gepresenteerd in figuur 1. We vergeleken de hoeveelheid glucose die vrijkwam na 30 minuten incubatie met α-amylase in aanwezigheid of afwezigheid van WEAX-fracties. Toevoeging van WEAX-fracties verminderde de hoeveelheid geproduceerde glucose getalsmatig in vergelijking met de controlebehandeling. Uit statistische vergelijkingen van de behandelingsgroepen en de controle bleek echter dat het gemiddelde verschil niet significant was () voor WA-f50, WA-f75, en WB-f75, ongeacht de WEAX-concentratie. De aanwezigheid van 0,5% WB-f50 resulteerde in een significante daling van de amylolyse ten opzichte van de controle (). Onze waarnemingen voor alfa-amylase activiteit stonden echter in contrast met andere rapporten in de literatuur, mogelijk als gevolg van de concentratie en het type van AX. Amylolyse van zetmeel werd uitgevoerd in aanwezigheid van 1 en 2% AX en de gebruikte AX was verstoken van ferulinezuur. Wij hebben AX-concentraties (~5-10 g) gebruikt die overeenkomen met die welke in studies bij mensen zijn gebruikt om de postprandiale bloedglucose te verlagen.

Figuur 1

Effect van met water extraheerbaar arabinoxylan op zetmeelhydrolyse.

Tabel 2 toont het effect van WEAX op de α-glucosidase-activiteit in aanwezigheid van sucrose of maltose als substraat. De gegevens zijn weergegeven als IC50, de concentratie van de remmer die resulteert in 50% remming van de α-glucosidase-activiteit. De IC50-waarden varieerden van 4,88-10,14 mg/ml tegen de α-glucosidase-activiteit met maltose als substraat. Er werd echter geen remming waargenomen wanneer sucrose als substraat werd gebruikt. De remmende werking van WEAX tegen intestinale maltase was 1000-2000 maal kleiner dan die van acarbose (een positieve controle). Algemeen wordt aangenomen dat viscositeit de oorzaak kan zijn van het effect van AX op postprandiale glucose. Vogel et al. voerden ratten daarom een gemodificeerd AX met tarwezemelen om het effect van viscositeit te bestuderen. Ook de remming van intestinale alfaglucosidase door mono-/oligosacchariden van AX werd in verband gebracht met hun ferulinezuurgedeelte. WA-f50 en WB-f75 hadden dus een significant verschillend remmend vermogen ten aanzien van de α-glucosidase-activiteit, ondanks het feit dat zij vergelijkbare relatieve verhoudingen hadden tussen niet-gesubstitueerde (niet–Xylp), monosubstitueerde (2-Xylp of 3-Xylp) en gedesubstitueerde xylose-residuen (2,3-Xylp) en de substitutiegraad, maar een verschillend ferulinezuurgehalte.

De verhouding tussen arabinose en xylose is een maat voor de mate van substitutie (DS). Er werd een sterk negatief lineair verband ( = -0,67) waargenomen tussen DS en IC50. Dit zou een gevolg kunnen zijn van de verhoogde oplosbaarheid van AX als gevolg van een hoge DS. Hoog gesubstitueerd WEAX lijkt dus een lagere IC50-waarde te hebben (hoge remmingspotentie). Dezelfde waarneming werd ondersteund door een negatieve associatie tussen remmingspotentie en het relatieve aandeel van niet-gesubstitueerde xylose residuen. De schijnbare verhouding tussen di-Xyl en mono-Xyl residuen leek geen invloed te hebben, maar de mate van xylose substitutie toonde een effect. Het is dus waarschijnlijk dat het effect op de α-glucosidaseactiviteit afkomstig is van arabinoseresiduen van WEAX. Er zijn rapporten over arabinose die de α-glucosidase-activiteit remt. Pogingen om arabinoseresiduen uit WEAX te verwijderen met behulp van arabinofuranosidase waren niet succesvol om de hypothese te bewijzen. We merkten echter op dat mono-Xyl op C (O)-2 een belangrijke determinant was in vergelijking met mono-Xyl op C (O)-3 wat suggereert dat de remmingspotentie verder ging dan de loutere aanwezigheid van een arabinose residu. Er was een sterke correlatie tussen mono-Xyl op C(O)-2 en het ferulinezuurgehalte ( = 0,99). Het is dus mogelijk dat de waargenomen invloed van DS zou kunnen zijn afgeleid van die van ferulinezuur.

De Lineweaver-Burk plot (figuur 2) werd gebruikt om de schijnbare maximumsnelheid () en Michaelis-Menten constante () te berekenen voor α-glucosidase activiteit op maltose in de aanwezigheid en afwezigheid van WEAX. Het effect van de WEAX-fractie op en werd geanalyseerd om het type remming te bepalen. en van α-glucosidase voor maltose in afwezigheid van WEAX-fracties waren respectievelijk 17,5 μg glucose per minuut en 5,99 mM. Uit tabel 4 blijkt dat door toevoeging van WEAX-fracties beide waarden daalden, wat erop wijst dat WEAX de α-glucosidaseactiviteit op niet-concurrerende wijze remt. Een typisch kenmerk van niet-concurrerende remming is dat beide en afnemen in aanwezigheid van de remmer. Het is dus aannemelijk dat WEAX-fracties zich binden aan het substraatcomplex van het enzym, waardoor zowel en afnemen. Arabinose bleek ook de α-glucosidase-activiteit te remmen via een niet-concurrerende modus.

Figuur 2

Lineweaver-Burk-plot van remming van α-glucosidase in de darmen van ratten door met water extraheerbare arabinoxylan ().

Onze resultaten kunnen een verklaring bieden voor de inconsistentie die in de literatuur is waargenomen over het effect van AX op het postprandiale glucosegehalte. Het voeden van Zuker-diabetische ratten met AX (Ara/Xyl = 0,9) aangevuld brood resulteerde in een significante daling van de postprandiale bloedglucosespiegel. Daarentegen had de inname van AX (Ara/Xyl = 0,5) geen effect op de bloedglucoserespons. Ook de toevoeging van 6 en 12 g AX aan het dieet (Ara/Xyl = 0,66 of 0,8) verlaagde de bloedglucose bij zowel gezonde als diabetische proefpersonen. AX (Ara/Xyl = 0,8) verminderde echter niet de postprandiale glucoserespons bij gezonde menselijke volwassenen. Varkens die werden gevoed met wit brood aangevuld met AX’s hadden een verminderde netto glucose flux in vergelijking met varkens die werden gevoed met wit brood . Het ontbreken van gedetailleerde chemische samenstelling en structuren maakt het moeilijk om de resultaten te vergelijken over de effectiviteit van AX . Dus ook al zijn de concentraties van de gebruikte AX’s gelijk, de effectiviteit zou afhangen van de aard van de gebruikte AX’s. Wij hebben aangetoond dat AX verkregen bij 50% verzadiging met ammoniumsulfaat een hogere remmingspotentie vertoonden dan AX verkregen bij 75%.

4. Conclusie

De resultaten van deze studie gaven aan dat de antiglykemische werking van arabinoxylanen kan worden afgeleid van het remmen van de intestinale α-glucosidase activiteit maar niet van de amylase activiteit. De potentie van het met water extraheerbare AX op de α-glucosidase activiteit werd beïnvloed door het ferulinezuurgehalte, de verhouding arabinose/xylose en het substitutiepatroon van xylose. De bevindingen suggereren ook dat remming van de α-glucosidase activiteit plaatsvindt via een niet-concurrerend mechanisme. Aldus kan de consumptie van voeding rijk aan water-extraheerbare AX de postprandiale bloedglucosespiegel verminderen.

Disclosure

Een deel van de resultaten werd gepresenteerd als een mondelinge poster op het Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP) symposium/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB) conferentie gehouden in het St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre van 20 april tot 22 april 2016.

Belangenconflicten

Alle ontvangen fondsen of materiële ondersteuning hebben niet geleid tot belangenconflicten bij de publicatie van dit manuscript.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) via het Discovery Grant Programme. De auteurs zijn ook dank verschuldigd aan Cargill Limited voor het leveren van tarwe aleuron monsters en Ce Zhou, Alison Ser, en Pat Kenyon van het Department of Food Science, University of Manitoba, voor hun technische ondersteuning.