De familie van cystathionine-β-synthase (CBS)-paar-domein tweewaardige metaalkation transport mediatoren (CNNMs) bestaat uit vier integrale membraaneiwitten die geassocieerd zijn met Mg2+-transport. Structureel bevatten CNNM’s grote cytosolische gebieden die bestaan uit een CBS-paar en een cyclisch nucleotide-bindend homologie (CNBH) domein. Hoe deze de Mg2+ transport activiteit reguleren is onbekend. Hier hebben we de kristalstructuren van cytosolische fragmenten in twee conformaties bepaald: Mg2+-ATP-analoog gebonden en ligandvrij. De structuren onthullen open en gesloten conformaties met functioneel belangrijke contacten die niet zijn waargenomen in de structuren van de afzonderlijke domeinen. We identificeerden ook een tweede Mg2+-bindend gebied in het CBS-paar domein en een ander dimerisatie-interface voor het CNBH-domein. Analytische ultracentrifugatie en isotherme titratie calorimetrie-experimenten toonden een nauwe correlatie aan tussen Mg2+-ATP binding en eiwit dimerisatie. Mutaties die één van beide functies blokkeerden verhinderden de cellulaire Mg2+ efflux activiteit. De resultaten suggereren dat Mg2+ efflux wordt gereguleerd door conformatieveranderingen geassocieerd met Mg2+-ATP binding aan CNNM CBS-paar domeinen.