Asymmetrische synthese van batrachotoxine: Enantiomeric toxins show functional divergence against NaV

De fenotypische effecten van acute vergiften die gevonden worden in de rijke farmacopeia van het aardse en mariene leven zijn gedocumenteerd sinds de oudheid. Door de isolatie en karakterisering van toxische verbindingen zijn belangrijke chemische reagentia beschikbaar gekomen voor het bestuderen van complexe biochemische circuits (1). Studies van dit type hebben een groot aantal peptide en kleine moleculen aan het licht gebracht die zich richten tegen spanningsgevoelige natrium ionenkanalen (NaVs), een verplichte klasse van membraaneiwitten voor bio-elektrische signalisatie (1-4). Onder de verzameling van bekende NaV modulatoren zijn drie structureel verwante middelen, (-)-batrachotoxine , veratridine, en aconitine (Fig. 1A)-sterisch grote, lipofiele aminederivaten waarvan wordt aangenomen dat ze een gemeenschappelijke bindingsplaats delen in de binnenste porie regio van NaV (3) (plaats 2, Fig. 1B). De invloed van deze toxinen op de ion-gating verschilt echter duidelijk. Aan de ene kant is (-)-BTX, het belangrijkste toxische bestanddeel van de Colombiaanse pijlgifkikkers (geslacht Phyllobates), een volledige NaV agonist, die het kanaal sneller doet openen bij hypergepolariseerde membraanpotentialen en snelle inactivatie blokkeert (naast andere karakteristieke effecten) (3-5). Omgekeerd kunnen de activiteiten van veratridine en aconitine het beste worden beschreven als respectievelijk partieel agonisme en remming van de kanaalfunctie (5). Ondanks recente inzichten uit de structuurbiologie in de driedimensionale architectuur van prokaryote NaVs (6-9), ontbreekt een moleculair begrip van de invloed van de site 2 toxines op de iongeleiding en ion-gating kinetiek. Structuur-activiteitsstudies van toxines, in combinatie met eiwitmutagenese-experimenten, kunnen vragen beantwoorden over de dynamische aard van de kanaalfunctie en kunnen richting geven aan het rationele ontwerp van kleine molecule-modulatoren van NaV-activiteit (1). De potentie van (-)-BTX (10), zijn legendarische geschiedenis als de archetypische small-molecule site 2 probe (4), en zijn ongeëvenaarde effecten op kanaal gating maken het een optimale “lead” verbinding voor dergelijke onderzoeken.

(-)-BTX binding aan NaVs verandert elk aspect van de kanaalfunctie, resulterend in een hypergepolariseerde verschuiving in de spanningsafhankelijkheid van activering, remming van zowel snelle als langzame inactivering, een afname van de enkel-kanaals geleiding, en vermindering van de ion selectiviteit (3, 4). Het gebruik van dit natuurlijke product als NaV-activator heeft geleid tot een aanzienlijke uitputting van de wereldvoorraad, die ooit meer dan 1 g bedroeg, maar in 2009 minder dan 170 mg bedroeg (11, 12). Sinds het toxine in 1963 voor het eerst werd geïsoleerd door Märki en Witkop uit giftige kikkers die werden verzameld in het noordelijke regenwoud van Colombia (13), is Phyllobates op de lijst van bedreigde diersoorten geplaatst, en is het verzamelen van natuurlijk (-)-BTX uit deze bron dus beperkt. (-)-BTX is ook geïdentificeerd in geselecteerde vogelsoorten (genus Pitohui en Ifrita) (14) en kevers (genus Choresine) (15), maar slechts in kleine hoeveelheden (bv. ~1,8 μg (-)-BTX per kever). Hoewel semi- (16) en racemische syntheses (17) van BTX-A (fig. 1C), een verbinding zonder de C-20 pyrrolester, zijn onthuld, sluit de lengte van elk van deze werken (>45 lineaire stappen) de gemakkelijke productie van (-)-BTX of geselecteerde analogen uit. Bijgevolg heeft onze wens om BTX en gemodificeerde vormen daarvan te gebruiken voor het onderzoeken van kanaaldynamica en ion-gating mechanismen onze inspanningen gemotiveerd om het natuurlijke product door middel van de novo synthese te verkrijgen.

Retrosynthetische analyse van (-)-BTX leidde ons tot het schetsen van een plan dat in een laat stadium de assemblage van de homomorfoline E ring en de uitwerking van de C-20 allylische ester (Fig. 1C) mogelijk zou maken, waardoor de toegang tot gemodificeerde vormen van het toxine zou worden vergemakkelijkt. Eerdere structuur-activiteitsrelaties met een klein aantal semisynthetische BTX derivaten (10, 18) en C/D/E-ring BTX analogen (19) toonden het belang aan van de C-20 ester, tertiair amine en tetracyclisch skelet voor de NaV agonistische activiteit. Het ontrafelen van BTX-A legt een steroïde-achtig frame 1 bloot, waarvan de assemblage wordt bemoeilijkt door twee hoekige groepen op de C/D-ring kruising, het C-11 exo-methyleen en het C-8/C-9 alkeen. Om de convergentie in ons synthetisch plan te maximaliseren, ontwierpen wij een ontkoppelingsstrategie voor 1 over de C-ring. Dit idee zou het probleem van de constructie van 1 in twee fragmenten verminderen, één waarin het A/B-ring systeem tot uitdrukking komt (3, 20) en een tweede dat het D-ring cyclopentaan omvat (4, 21). De succesvolle uitvoering van dit schema zou kunnen produceren het gewenste toxine door middel van een opeenvolging van lineaire stappen in totaal niet meer dan 20 tot 25.

Onze synthese van (-)-BTX begon met de koppeling van methyleencyclopentanon 4 (21) (fig. S1A) en vinylbromide 3, benaderd uit (S)-(+)-Hajos-Parrish keton via een gewijzigde volgorde van stappen oorspronkelijk geschetst door Parsons en medewerkers (20) (fig. S1B). Het samenvoegen van de fragmenten 3 en 4 om de gekoppelde A/B/D-tricel 5 te genereren, vormde de eerste van een reeks uitdagingen op het gebied van procesontwikkeling. Een eerste poging om deze transformatie uit te voeren betrof Li-Br uitwisseling van 3 met n-BuLi (Bu, butyl) en sequentiële toevoeging van enon 4. Hoewel 5 onder deze omstandigheden werd geleverd, kwam het productrendement nooit boven 30%. Deuterium quenching experimenten met D2O bevestigden onze hypothese dat α-deprotonatie van 4 concurrerend was met de gewenste keton additie route. Transmetaleringsreacties van de vinyl-lithiumsoorten met ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, ethyl), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluormethansulfonaat), CeCl3-2LiCl, en LaCl3-2LiCl werden onderzocht, maar geen van deze maatregelen bleek effectief (22, 23). De toevoeging van een equivalent van watervrij LiBr aan het reactiemedium van 3 verbeterde de koppeling efficiëntie met >20% (24). Naar aanleiding van dit spoor, een geoptimaliseerd protocol met behulp van 2,1 equivalenten van t-BuLi, die vermoedelijk genereert een equivalent van LiBr in situ, reproduceerbaar veroorzaakte 5 als een enkele diastereomeer in 65% opbrengst op een multigram schaal. Het gemak van de synthese van dit materiaal en zijn gedesilyleerde vorm 6 maakte latere inspanningen om de voorwaarden voor tandem annulatie van de C-ring en de installatie van de quaternaire C-13 centrum te identificeren.

Een evaluatie van de beschikbare methoden voor ringsluiting van 1,6-enynen leidde ons om radicaal geïnitieerde processen (25) te overwegen. Onder dergelijke omstandigheden zou een beginnend C-13 3° radicaal onderschept kunnen worden om de hoekige aminomethyleeneenheid (of een geschikt surrogaat) te smeden. Pogingen om eerst de vorming van de C-ring van 6 te onderzoeken, brachten echter de mogelijke misvatting van dit plan aan het licht. Het gebruik van n-Bu3SnH en triethylboraan (Et3B) om de cyclisatie te bevorderen resulteerde in de vorming van twee isomeren, 7 en 8, in een 1:5 verhouding ten gunste van het ongewenste product (Fig. 2A). Studies van Stork en Beckwith en medewerkers hebben aangetoond dat substraatconcentratie en reactietemperatuur de wijze van cyclisatie (d.w.z. 5-exo-trig versus 6-endo-trig) in radicaal-gemedieerde enyne reacties kunnen beïnvloeden (26, 27). Bij verhoogde temperatuur (130 ° C) en met vijfvoudige verdunning van 6, een omkering in selectiviteit werd waargenomen, waardoor een lichte overmaat van de gewenste tetracycle (1,3:1 verhouding van 7 tot 8; Fig. 2A). Het gecombineerde productrendement van deze omzetting bedroeg meer dan 90%, wat verdere exploratie van deze chemie aanmoedigt, ondanks de bescheiden selectiviteitsresultaten.

Herhaalde pogingen om het tussenliggende C-13 radicaal te vangen met oxime- en hydrazonederivaten gegenereerd uit formaldehyde leverden niet het verwachte aminomethyleringsproduct op (28). Gedwongen om alternatieve oplossingen te overwegen, erkenden we dat een gemodificeerde silyl-ethergroep, toegevoegd aan de naburige C-14 alcohol, geschikt zou zijn om het 3° radicaal te onderscheppen (29). Op basis van de beschikbare precedenten werd een alkynylsilylchloride, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, methyl), geselecteerd voor de modificatie van de C-14 alcohol in 6 (30, Fig. 2A). Behandeling van de resulterende silylether (9) met n-Bu3SnH en Et3B bij 150°C resulteerde in een cyclisatiecascade om pentacyclus 10 als het exclusieve product te geven (31). Binnen de grenzen van de proton kernspinresonantie (1H NMR) detectie werd geen van de corresponderende vijf-ring C-isomeren gegenereerd in dit proces. Onze eerste pogingen om de rol van C-14 substituentgroepen op de reactieselectiviteit te begrijpen, suggereren dat silylbescherming van de alcohol (samen met de verhoogde reactietemperaturen) de 6-endo-trig ringsluiting bevordert. Hoewel aanvullende studies gerechtvaardigd zijn om deze structuur-selectiviteit gegevens te waarderen, onze enyne cyclisatie cascade biedt een convergente aanpak voor de synthese van gesubstitueerde steroïde scaffolds en moet de toegang tot een breed scala van dergelijke verbindingen te vergemakkelijken.

Nauwkeurige inspectie van de radicale cyclisatie producten afgeleid van ofwel 6 of 9 bleek een onverwachte uitkomst met betrekking tot de structuur van de resulterende organostannaan-groep (Fig. 2, A en B). Carbostannylering van de alkyne groep zou een vinyl-tin product moeten opleveren, zoals waargenomen bij de reactie van 6. Onverwacht, toen 9 werd onderworpen aan de reactievoorwaarden, was allylstannaan 10 het enige product, een resultaat dat zowel door NMR als röntgenkristallografie werd bevestigd. De vorming van allylstannaan 10 kan worden beredeneerd via een mechanisme met 1,4-H-atoomoverdracht van een tussenliggend vinylradicaal (32) (fig. 2B), een voorstel dat wordt ondersteund door een deuteriumlabelingexperiment (fig. S5). Hoewel dit resultaat niet gepland was, dwongen de efficiëntie en selectiviteit van de cyclisatiereactie ons ertoe dit materiaal verder te ontwikkelen. Vooruitkijkend moet de veelzijdigheid van de allylstannaan-groep toekomstige inspanningen dienen om C-ring-gemodificeerde BTXs.

De beschikbaarheid van 10 in negen stappen van de Hajos-Parrish keton maakte de productie van aanzienlijke hoeveelheden materiaal mogelijk om de doelsynthese te voltooien. Excisie van de overbruggende silylether in 10 werd bereikt met een overmaat n-Bu4NF, waarbij een diol intermediair werd onthuld dat vervolgens werd opgevoerd tot 11 door 2-iodoxybenzoëzuur-gemedieerde alcoholoxidatie en chemoselectieve vinylsilaan splitsing (57%; Fig. 2B). De omzetting van aldehyde 11 in chlooracetamide 12 vond plaats in drie stappen in een enkelvoudige kolf (16, 33). Van 12 leverde efficiënte sluiting van de homomorpholinamide ring met NaOEt (92%) (17) een veelzijdig tussenproduct op voor modificatie van zowel de C- als de D-ringeenheden. Dit laatste kon worden bereikt via het D-ring enol triflaat, bereid met KN(SiMe3)2 en PhNTf2.

Inductie van de C-11α alcohol uit de C-ring allylstannaan 13 vormde een van de moeilijkere uitdagingen in onze benadering van BTX (Fig. 2B). Hoewel protodestannylering van 13 om de overeenkomstige C-11 exo-methyleencyclohexaan te genereren beperkt succes had (34), faalden alle daaropvolgende pogingen om deze verbinding te oxideren tot keton 15 (d.w.z. O3, OsO4, en RuO4) om product te geven. Geïnspireerd door een verslag van Kim en Fuchs, probeerden wij 13 om te zetten in de overeenkomstige allylchloride met behulp van CuCl2 (35). Toevallig, het uitvoeren van deze reactie in dioxaan onder aërobe omstandigheden leverde enal 14 in 85% opbrengst met slechts een kleine hoeveelheid van het gechloreerde product (~10%). Hoewel de mechanistische details van deze omzetting onduidelijk blijven, is ons slechts één ander gedocumenteerd voorbeeld bekend van een dergelijke oxidatiereactie, waarbij gebruik wordt gemaakt van een vanadiumkatalysator en O2 (36). Enal 14 is geschikt voor omzetting in C-11 keton 15 door het volgen van een reeks interconversiestappen tussen functionele groepen, gemarkeerd door een Curtius-herschikking (37). De afwezigheid van een levensvatbare chromofoor op batrachotoxine A (BTX-A) bemoeilijkt de zuivering van dit materiaal; derhalve werd in de sequentie die leidt tot 15, het C-3 methoxyacetaal uitgewisseld met p-methoxyfenethylalcohol.

Voltooiing van het koolstofskelet van (-)-BTX werd bereikt door een palladium-gekatalyseerde kruiskoppeling van tributyl(1-ethoxyvinyl)tin tot vinyltriflaat 15 (Fig. 3A) (38). In situ hydrolyse van de incipient enol ether met 1 M oxaalzuur leverde enon 16 (77%). Na een uitgebreide screening van reductiemiddelen, werd succesvolle stereoselectieve globale reductie van enon 16 bereikt in 33% opbrengst door behandeling met vers bereide AlH3 (39). Wij stellen de hypothese dat het Lewis-basische lactam (of een gereduceerde vorm) fungeert als een centraal stereocontrolerend element, aangezien behandeling van enone 15 met alternatieve hydride-reductiemiddelen uitsluitend de ongewenste C-11β alcohol opleverde. Het gebruik van AlH3 bevorderde ook de generatie van de juiste C-20 allylische alcohol epimer, een sterochemisch resultaat dat kan worden gerationaliseerd door middel van een model waarin chelatie controle (38). Deprotectie van het product van AlH3 reductie onder zure omstandigheden leverde (-)-BTX-A op in 83% opbrengst (17). Tenslotte werd door een wijziging van het (-)-BTX-A acyleringprotocol van Tokuyama, Daly en Witkop met het uit ethylchloroformaat en 2,4-dimethyl-pyrrol-3-carbonzuur (10) bereide gemengde anhydride de synthese van 2 mg (-)-BTX voltooid (79%, 0,25% totaalrendement) in 24 stappen uit (S)-(+)-Hajos-Parish keton. Het product was in alle opzichten identiek aan een monster van het natuurlijke materiaal en aan eerder geregistreerde spectroscopische gegevens (40, 41). Ons synthetisch plan maakte ook de bereiding op milligramschaal mogelijk van de tegenhanger van het onnatuurlijke toxine, (+)-BTX, de bekende benzoaat ester van (-)-BTX-A (BTX-B; fig. 3B) (42, 43), en de enantiomeer van deze verbinding (ent-BTX-B).

Electrofysiologische karakterisering van synthetische (-)-BTX en BTX-B tegen rat NaV1.4 (rNaV1.4) bevestigde dat de laatste ook als agonist fungeert en in potentie vergelijkbaar is met het natuurlijke product (fig. S6 en tabel S12). Uit eerdere rapporten en onze eigen studies blijkt dat de estergroep van BTX-B stabieler is dan de oxidatiegevoelige acylpyrrool van BTX; daarom werden aanvullende experimenten uitgevoerd met de eerstgenoemde verbinding (42, 43). Synthetische BTX-B werd getest tegen een subset van representatieve NaV-isovormen, waaronder rNaV1.4, menselijke NaV1.5, en menselijke NaV1.7. Toepassing van 10 uM BTX-B op Chinese hamster eierstokcellen die een enkel NaV subtype tot expressie brengen resulteerde in aanhoudende natriumstroom in alle gevallen (Fig. 4A en figs. S7 en S8). Gebruik-afhankelijk agonisme van NaV isovormen door BTX-B voorkwam steady-state inactivatie van >80% van de natriumkanaal populatie (Fig. 4A en fig. S8). BTX-B induceerde ook een karakteristieke hyperpolariserende verschuiving (-44.9 tot -51.5 mV) in de half-maximale spanning (V0.5) van activatie van wild-type NaV isovormen (Fig. 4B en tabel S13). De gelijkenis van deze gegevens is consistent met het hoge behoud van de eiwitsequentie tussen NaV subtypes in de binnenste porie-voerende S6 helices die de vermoedelijke toxinebindingsplaats vormen (fig. S9).

Naar aanleiding van eerder werk van ons laboratorium (19) en anderen (44, 45) vroegen wij ons af of de enantiomeervorm van BTX zich met hoge affiniteit aan NaV zou binden met analoge functionele effecten. Een dergelijke vraag kan alleen beantwoord worden met de beschikbaarheid van een de novo synthese van het toxine. Daarom werden elektrofysiologische opnamen met ent-BTX-B uitgevoerd tegen rNaV1.4. Deze gegevens toonden aan dat ent-BTX-B een gebruiks- en toestandsafhankelijke kanaalantagonist is, met een gemeten half-maximale remmende concentratie van 5,3 ± 0,6 μM . De concentratie voor de half-maximale remming van NaV door ent-BTX-B is vergelijkbaar in grootte met de half-maximale effectieve concentratie voor BTX-B agonisme (1,0 ± 0,1 uM; fig. S10) gemeten onder identieke omstandigheden. Opmerkelijk is dat, in tegenstelling tot de natuurlijke antipode, ent-BTX-B binding slechts een minimale verschuiving veroorzaakte in de V0.5 van activering en de V0.5 van steady-state inactivering (tabel S14). Bovendien was kanaalblokkade volledig omkeerbaar door deze remmer.

Om te bepalen of BTX-B en ent-BTX-B een overlappende bindingsplaats delen binnen het binnenste poriegebied van NaV, werd ent-BTX-B getest tegen vijf rNaV1.4 single-point mutanten waarvan eerder is aangetoond dat ze BTX-binding destabiliseren (Fig. 4, E en F, en fig. S12) (19). Mutatie van N434 (46), L1280 (47), F1579 (48), en N1584 (48) tot lysine resulteerde in een ~ 3- tot 30-voudige afname van de huidige blokkeren door 5 uM ent-BTX-B. Tegen F1236K (49) echter, behield ent-BTX-B een significante activiteit (33,6 ± 2,1% stroomremming). Het duidelijke verschil tussen ent-BTX-B en BTX-B wijst op een overlappend, maar niet-identiek, bindingsgebied binnen de binnenporieholte. Het lijkt erop dat het open kanaal voldoende groot is om ruimte te bieden aan lipofiele tertiaire amine liganden (19, 45, 50). Subtiele veranderingen in de bindingspositie van deze liganden blijken de functionele respons van het eiwit ingrijpend te veranderen. Toekomstige onderzoeken zullen worden gericht op het afbakenen van de precieze kanaal-toxine interacties die activering onderscheiden van remming door BTX derivaten en verwante lipofiele toxines.