Bactericide activiteit van groene thee extracten: het belang van catechine bevattende nano deeltjes

Bioactiviteitstesten- Anti-Streptokokken activiteit

De drie verschillende groene thee’s en hun extracten en deeltjes verkregen bij 5000 omwentelingen per minuut en 10000 omwentelingen per minuut en 20000 omwentelingen per minuut werden bestudeerd voor hun antibacteriële eigenschappen tegen de tand pathogeen, S.mutans. Om de concentratie van het groene thee-extract voor verdere experimenten te optimaliseren, werden zes verschillende concentraties (0 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl en 500 μl) van GT-0 (zonder deeltjes te verwijderen) en 5K-S van GT 1, GT 2 en GT 3 getest tegen S. mutans. Figuur 2 toont de resultaten van deze studie. Zoals blijkt uit fig. 2(a), toonde de spectrofotometrische methode aan dat in het geval van GT-0 en 5K-S ten opzichte van alle drie de groene theesoorten, de anti-streptokokkenactiviteit toenam met toenemende concentratie. Concentraties van 300 μl werden waargenomen als de optimale antimicrobiële activiteit en werden daarom beschouwd als de optimale concentratie voor alle andere experimenten in deze studie. Dus, van nu af aan, werden alle experimenten uitgevoerd met 300 pi concentraties van de groene thee variabelen. Figuur 2 (b) toont de resultaten verkregen door antimicrobiële beoordeling met behulp van de totale levensvatbare aantal methode. De resultaten van het kiemgetal komen overeen met die van de troebelheidsmetingen met de spectrofotometer. Een andere interessante waarneming uit deze resultaten is de marginale verbetering van de antimicrobiële activiteit die is waargenomen bij verwijdering van de deeltjes bij 5000 omwentelingen per minuut (5K-S) in vergelijking met GT-0. In vergelijking met GT 1-0 vertoonde GT 1-5K-S een verhoogde antibacteriële activiteit, net als GT 2 en GT 3. Bovendien vertoonde GT 3 de hoogste antibacteriële activiteit en GT 1 de minste antibacteriële activiteit.

Omdat het verwijderen van de deeltjes uit de groene thee veranderingen in de bioactiviteit van het groene thee-extract aan het licht bracht, werd voorgesteld een gedetailleerd onderzoek in te stellen om dit effect te bestuderen. Er werd een systematisch centrifugeerproces in drie stappen uitgevoerd, bij 5000 omwentelingen per minuut, 10.000 omwentelingen per minuut en 20.000 omwentelingen per minuut, bedoeld om de grootste, kleinere en nog kleinere deeltjes van het extract te scheiden. Het extract van de grote deeltjes (5K-S), kleine deeltjes (10K-S) en fijne deeltjes (20K-S) en de deeltjes (5K-P, 10K-P en 20K-P) werden bestudeerd op hun interactie met S. mutans en hun afzonderlijke antibacteriële activiteiten. Figuur 3 geeft de resultaten van dit onderzoek. Zoals in fig. 3(a-1,a-2) te zien is, bevestigden zowel de troebelheidsmethode als de kiemgetalmethode dat verwijdering van 5K-P in vergelijking met GT 1-0 tot een (marginale) verbetering van de antibacteriële activiteit van het extract (5K-S) leidde. De verwijdering van 10K-P resulteerde niet in een verdere verbetering en 10K-S werd meestal vergelijkbaar bevonden met de 5K-S-activiteit. De verwijdering van 20K-P’s resulteerde echter in een duidelijk verlies van antimicrobiële activiteit in 20K-S. Deze waarneming was duidelijk in het geval van GT 2 (Fig. 3(b-1,b-2)) en GT 3 (Fig. 3(c-1,c-2)). Hoewel de trend varieerde van GT 1 tot GT 2 tot GT 3, blijft het feit dat de verwijdering van de grote groene thee deeltjes uit het extract de antibacteriële eigenschap van het groene thee extract marginaal verhoogde en dat de uitroeiing van de kleinere groene thee deeltjes fracties uit het extract leidde tot een duidelijke afname van de antibacteriële activiteit van de groene thee onbetwist.

Het is echter belangrijk om hier te benadrukken dat noch de 5K-P, 10K-P, noch de 20K-P deeltjes een hogere stand-alone antibacteriële activiteit vertoonden dan de extracten. 5K-P partikels vertoonden geen antibacteriële activiteit, 10K-P vertoonde een beperkte mate van antibacteriële activiteit, terwijl de 20K-P partikels enige activiteit vertoonden temidden van de andere twee tegenhangers.

Real time testing of dental bactheria

Om deze variatie in de bioactiviteit van de groene thee extracten te evalueren van de groene thee partikels in real time systemen, werden de extracten opgezet tegen echte monsters van tandheelkundige biofilm van vijf verschillende menselijke vrijwilligers. GT 0, 5K-S en 20K-S van GT 1, GT 2 en GT 3 werden getest. Figuur 4 geeft de totale levensvatbare tellingen volgens de plaattellingmethode, met aanduiding van de bacteriën die de interactie met groene thee overleefden. Het was interessant om vast te stellen dat 5K-S, ondanks de complexiteit van het monster, in vergelijking met GT 0 een verhoogde antibacteriële activiteit vertoonde, terwijl 20K-S een verlaagde antibacteriële activiteit vertoonde ten opzichte van alle drie de groene theeën.

Fluorescentiebeeldvorming van de cellen met acridine oranje, helpt bij de visualisatie en differentiatie tussen levende/dode cellen na behandeling. We hebben de tandbiofilmmonsters van de vijf vrijwilligers vóór en na interactie met GT 0, 5K-S en 20K-S en controle belicht. Figuur 5 toont de fluorescentie resultaten tonen effect van de groene thee variabelen op vrijwilliger 1 (A), vrijwilliger 2 (B), vrijwilliger 3 (C), vrijwilliger 4 (D) en vrijwilliger 5 (E). Zoals waargenomen in Fig 5 (a), de controle beelden in A, B,C,D en E tonen overwegend oranje fluorescentie duidt op de aanwezigheid van actief metaboliseren levende tandheelkundige bacteriën. Zoals uit het beeld blijkt, behielden de losgemaakte biofilms van de tanden hun biofilmidentiteit en verschijnen ze als microbiële matten in het geval van de controle. De GT 0 behandeling resulteerde in het verwachte dodende effect van groene thee (Fig. 5(b)) in het geval van alle vrijwilligers. De groen fluorescerende gebieden (dode cellen) overheersten, met daartussen gebieden met oranje fluorescentie. Paneel (c) toont de resultaten van het 5K-S supernatant van GT 3, waar de grootste groene theedeeltjes uit het extract werden verwijderd. Zoals uit de fluorescentiemicroscopische beelden blijkt, werd er geen oranje fluorescentie waargenomen en een volledig groene fluorescentie die wijst op een totale vernietiging van de tandbacteriën/biofilm. Het was ook interessant om te zien dat er geen biofilm patches of matten meer werden waargenomen, de biofilm matten waren gedesintegreerd en het enige wat werd waargenomen waren verspreide cel klontjes in alle test monsters (A(c), B(c).C(c).D(c) en E(c). Fig. 5(d) tenslotte geeft de 20K-S interactie resultaten, een significante daling in het dodend effect van het groene thee extract is duidelijk. Het optreden van de oranje fluorescerende levende bacteriële cellen wijst op een afname van de antimicrobiële activiteit van het extract bij verwijdering van de nano groene thee bestanddelen. Hoewel ook groen fluorescerende dode cellen worden waargenomen, leek de verhouding tussen de levende en dode cellen veranderd. Deze resultaten bevestigden de via de spectrofotometrische methode en de plaattellingmethode gerapporteerde trend van de antimicrobiële activiteit van de verschillende testcomponenten van groene thee.

FE-SEM observatie van de controle en 5K-S interacted tandheelkundige bacteriën wordt gegeven in Fig. 6 (a-c). Zoals uit de figuur blijkt, vertoont de controle (Fig. 6(a)) een goed ontwikkelde biofilm (Vrijwilliger 4), terwijl de interactie tussen GT 0 (Fig. 6(b)) of GT 3 en 5K-S (Fig. 6(c)) resulteerde in beschadiging van de cellen en de biofilm, zoals aangegeven door de celresten. Beelden gemaakt met CLSM (d) tonen aan dat een grote meerderheid van de tandbacteriën van alle vijf vrijwilligers werden gedood door GT 3 (5K-S). GT 3-GT 0 en 5K-S bleken het meest veelbelovend tegen de tandbacteriën van alle vrijwilligers.

Karakterisering van extract en deeltjes

Nadat de resultaten van de bioactiviteitstests op basis van de antibacteriële activiteit van de groene thee bestanddelen aantonen dat de aan- en afwezigheid van de groene thee deeltjes inderdaad de activiteit van het extract verandert, is het noodzakelijk dat de extracten GT 0, 5K-S, 10K-S en 20K-S en vervolgens de deeltjes 5K-P, 10K-P en 20K-P van de drie groene theeën uitvoerig worden gekarakteriseerd.

Biochemische karakterisering

Antibacteriële activiteit wordt in het algemeen bepaald door het totaal fenolisch gehalte, de flavanoïden en de antioxiderende werking van een extract. Al deze parameters werden bestudeerd en vergeleken tussen de extracten en de deeltjes die in deze studie werden gebruikt. Figuur 7(a) toont de resultaten verkregen in het geval van GT 1, in het geval van flavanoïden, zoals waargenomen in de grafiek, werd niet veel verschil waargenomen in het flavanoïde gehalte tussen GT 0, 5K-S, 10K-S en 20K-S extracten, GT 0 bleek een marginale toename te vertonen in vergelijking met de rest. In het geval van de groene theedeeltjes vertoonde 5K-P echter het hoogste gehalte aan flavanoïden, gevolgd door 10K-P en 20K-P met een gehalte aan flavanoïden dat vergelijkbaar is met dat van de extracten. In het geval van GT 2, fig. 7(b), en GT 3, fig. 7(c), was het flavanoïdengehalte verschillend, 5K-S en 10K-S extracten vertoonden de hoogste flavanoïdengehalten vergeleken met GT 0. De 5K-P en 10K-P deeltjes vertoonden zeer lage flavanoïdengehalten. De uitzonderingen waren dat de 20K-S-extracten minder flavanoïden lieten zien vergeleken met de andere extracten en de 20K-P-deeltjes hogere flavanoïden lieten zien vergeleken met de andere deeltjes.

Wat het totaal aan fenolen betreft, werd in GT 1 het hoogste gevonden in GT 0, terwijl de rest minder hoge waarden liet zien. In het geval van GT 2 en GT 3 werd echter opnieuw een soortgelijke trend waargenomen met betrekking tot het fenolgehalte, waarbij alle extracten bijna dezelfde fenolgehalten vertoonden. Maar de 5K-P en 10K-P vertoonden de minste fenolgehalten in vergelijking met 20K-P.

In termen van antioxidant activiteit, vertoonden de GT 1 extracten (GT 0, 5K-S, 10K-S en 20K-S) een zeer hoge antioxidant activiteit, terwijl 5K-P en 10K-P een zes keer lagere antioxidant activiteit vertoonden. Hierbij moet echter worden vermeld dat de 20K-P’s een significant hogere antioxidantwerking vertoonden in vergelijking met de 5K-P en 10K-P. In GT 2 en GT 3 was deze trend meer uitgesproken, waarbij de 5K-S en 10K-S een hogere antioxidantwerking vertoonden in vergelijking met GT 0. Maar een duidelijke afname van de antioxidantwerking werd waargenomen in het geval van 20K-S met een overeenkomstige toename van de activiteit in 20K-P’s van GT 2 en GT 3. Opgemerkt moet worden dat van de drie bestudeerde groene theesoorten, GT 3 hogere waarden van deze bioactieve verbindingen te zien gaf, op de voet gevolgd door GT 2 en uiteindelijk met een aanzienlijke achterstand op GT 1. Deze tendens correleert sterk met de antimicrobiële bioactiviteit van de groene theeën die in de volgorde van GT 3 > GT 2 > GT1.

FE-SEM analyse

De 5K-P, 10K-P en 20K-P deeltjes werden met FE-SEM afgebeeld voor hun morfologische details en afmetingen. Figuur 8 geeft de 5K-P (a), 10K-P (b) en 20K-P (c) morfologieën van de deeltjes van GT 1 (A), GT 2 (B) en GT 3 (C). Onregelmatige morfologieën zonder duidelijke vorm werden in de meeste gevallen waargenomen. Zoals blijkt uit fig. 8, zijn de 5K-P deeltjes in GT 1 en GT 2 macro-groot, dit zijn de deeltjes die we zichtbaar zien in ons kopje groene thee. Tabel 1 geeft hun grootte weer, GT 2 (B) 5K-P deeltjes waren het grootst (50-80 μm), gevolgd door GT 1 (B(a)) die tussen 15-25 μm groot waren. GT 3 5K-P deeltjes waren relatief kleiner in het bereik van 6-30 μm (Fig. 8(C(a)). Zoals op de microfoto’s te zien is, hadden de deeltjes geen vaste afmetingen, wat te verwachten is van dergelijke ruwe, niet-gestandaardiseerde commerciële monsters. De 10K-P deeltjes hadden een microgrootte van 4-10 μm in het geval van GT 1 (A(b)), GT 2 was 2-10 μm (Fig. 8B(b)) en GT 3 had een grootte van 0,5-3 μm (C(b)). De 20K-P deeltjes waren kleiner van microgrootte tot nanogrootte, met GT 1 deeltjes in het 0,5-6 μm regime (A(c)), GT 2 deeltjes (B(c)) waren 200 nm tot 540 nm en GT 3 (C(c)) deeltjes waren het kleinst en bestonden in het grootte regime van 50 nm-300 nm. Uit deze resultaten blijkt dus dat 20K-P-deeltjes die over verbeterde bioactieve bestanddelen beschikten en antioxiderende en antibacteriële eigenschappen vertoonden, zich in het bijna-nanoregime bevonden.

UV-Vis Spectrofotometrie

Figuur 9 geeft het UV-Vis spectrum van de extracten en de deeltjes gekarakteriseerd voor hun EGCG gehalte. Atomssa & Gotlap 201539 hebben de extinctie voor de catechinefamilie gerapporteerd: EGCG vertoont een absorptie in het bereik van 248-361 nm in water met λmax bij 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax bij 276,8 nm; het spectrale bereik van EGC in water is 254-378 nm en λmax bij 269,6 nm en dat van EC is 252-328 nm met λmax bij 278,4 nm. Zoals waargenomen in Fig. 9(a) GT-1, zien we alleen de EGCG absorptiepiek bij 273 nm. Wat de EGCG-piek betreft, werd geen verschil waargenomen binnen de extracten (GT 0, 5K-S, 10K-S en 20K-S). In het geval van de groene theedeeltjes werd echter waargenomen dat de 20K-P deeltjes een aanzienlijke toename van de EGCG-intensiteit vertoonden in vergelijking met de 5K-P en 10K-P’s. Het was interessant vast te stellen dat de 20K-P’s bijna 50% EGCG in de extracten bevatten.

In het geval van GT 2 werd waargenomen dat de extracten de aanwezigheid vertoonden van andere pieken van de catechinefamilie in het bereik van 248-363 nm, zoals blijkt uit de verschillende piekpieken in dit bereik in Fig. 9(b). De verwijdering van de deeltjes uit het extract leidde tot verschuivingen in de pieken. Vooral de extracten vertoonden duidelijke verschuivingen. In het geval van de deeltjes 5K-P en 10K-P werd echter waargenomen dat ze alleen EGCG-pieken vertoonden en bij lage intensiteit. De nadruk ligt hier op de 20K-P deeltjes die bijna even intense catechine pieken vertoonden in vergelijking met de extracten. In tegenstelling tot de 5K-P’s en 10K-P’s vertoonden de 20K-P’s niet alleen EGCG-pieken, maar ook de andere catechinefamilie pieken, eerder vergelijkbaar met de extracten.

GT 3 (fig. 9(c)), de extracten leverden verschillende pieken op, waaronder de catechinepieken. In vergelijking met GT 1 en GT 2 vertoonden de 5K-P en 10K-P deeltjes zelf echter EGCG-pieken met een hoge intensiteit. De trend dat de 5K-P en 10K-P’s alleen EGCG-pieken vertoonden, hield ook in GT 3 aan. 5K-P vertoonde een hogere EGCG-piek in vergelijking met zijn GT-1- en GT-2-tegenhangers, maar in vergelijking met 10K-P’s van GT 3 was die veel lager. De 10K-P van GT 3 vertoonde EGCG-gehaltes die vergelijkbaar waren met die in de extracten. De 20K-P’s vertoonden in dit geval de hoogste catechinepieken, waarmee ze ook de extracten overtroffen. Bij de 20K-P’s Vs de extracten werden dezelfde piekverschuivingen waargenomen als bij de 20K-P’s bij waterextractie en solventextractie. Het was interessant op te merken dat de 20K-P pieken smaller waren en een hoge intensiteit hadden. Een uitzonderlijk hoge piek bij 269 nm, die overeenkomt met EGC, werd waargenomen in de 20K-P’s. De algemene observatie dat de 20K-P’s aanzienlijk grote hoeveelheden catechines bevatten in GT-1, GT 2 en GT 3 werd door deze studies bevestigd.

FT-IR

Het FT-IR spectrum verkregen uit de deeltjes 5K-P, 10K-P en 20K-P van GT 3 die de maximale antibacteriële activiteit en unieke eigenschappen vertoonden, wordt gepresenteerd in Fig. 10(a). De spectra komen overeen met de karakteristieke band van EGCG. Ponnuraj et al, 201540 rapporteren EGCG fingerprints bij 3357,46 cm-1 voor O-H groep verbonden aan de aromatische ring, 1691,27 cm-1 en 1616,06 cm-1 sterk voor C = O groep die de trihydroxybenzoaat groep en chroman groep verbindt, 1447,31 cm-1 voor C-H groep aanwezig in de Chroman ring, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 voor O-C = O groep, 1148,40 cm-1 voor O-H groep, 1041,37 cm-1 voor C-O-C groep die de Chromaan ring en trihydroxybenzoaat ring verbindt en 825,38 cm-1 voor C-H groep in de aromatische ring. Het was interessant en ondersteunend om te zien dat een duidelijk patroon werd waargenomen als functie van toenemende centrifugering, hetgeen overeenkomt met afnemende deeltjesgrootte. Bij 5K-P waren de EGCG-banden het laagst in intensiteit, gevolgd door 10K-P en 20K-P vertoonden banden met een hoge intensiteit. Dit komt ook overeen met de resultaten van de UV-studies.

Figuur 10(b) toont de FT-IR-spectra van 5K-P en 20K-P van GT 1. In het geval van GT 1 was er niet veel verschil in de EGCG-banden tussen de twee deeltjes. Deze resultaten komen ook overeen met de resultaten van de UV-spectrofotometrische studies. Figuur 10 (c) geeft de vergelijkende spectra van de 20K-P’s van GT 1, GT 2 en GT 3. Het gradiëntpatroon van de toegenomen EGCG-banden in de volgorde van GT 1 < GT 2 < GT 3 is duidelijk.