Van de DNA fragmenten die we aanvankelijk probeerden te amplificeren, produceerden alleen tlp2, che1P, en cheA1 (Tabel 1) een PCR amplificatie product zonder het gebruik van oplosmiddel toevoegingen, wanneer genomisch DNA van A. brasilense als sjabloon werd gebruikt (Figuur 1). De effecten van DMSO bij 1,25%, 2,5%, 5,0%, 7,5%, en 10%, (w/vol) alsmede formamide bij vergelijkbare concentraties als additieven in PCR werden eerst getest (figuur 1). Een set van PCR werd ook uitgevoerd met BSA op 1-10 ug / ml (gegevens niet weergegeven). In overeenstemming met gegevens uit de literatuur, terwijl zowel DMSO of formamide toevoeging in PCR bevorderd verhoogde opbrengst van amplificatie van DNA-fragmenten van 2-3 kb, het versterkende effect van DMSO was groter dan die van formamide (figuur 1). Onder deze omstandigheden hebben wij ook geconstateerd dat verhoging van de concentratie DMSO ook kan leiden tot afname van de PCR-specificiteit (figuur 2). Anderzijds nam het effect van formamide ter bevordering van een grotere PCR-opbrengst af voor DNA-fragmenten groter dan ongeveer 2,5 kb (figuur 1). Er was geen significant effect van het toevoegen van BSA alleen als een PCR additief, onder deze omstandigheden, met inbegrip van geen nadelig effect (gegevens niet weergegeven). De versterkende effecten van BSA op de PCR-opbrengsten werden gedetecteerd bij gebruik in combinatie met DMSO of formamide, over een breed spectrum van DNA-fragmentgroottes (figuur 2). Bovendien verbreedde de toevoeging van BSA het bereik van de concentraties waarvoor het organische oplosmiddel kon worden toegevoegd, zelfs voor DNA-sjablonen van grotere afmetingen (figuur 2). De consensus van de huidige literatuur over formamide geeft aan dat het het meest effectief is als PCR-additief bij concentraties van 0 tot 5%, waarbij de effectiviteit volledig wegvalt bij 10%. Uit onze resultaten blijkt dat in aanwezigheid van BSA, formamide effectief is ten minste tot concentraties van 10% en met DNA-sjablonen tot 2,5 kb in grootte (tlp2), maar het niet amplificatie van DNA-fragmenten van grotere omvang (figuur 1) te bevorderen. Dit resultaat is consistent met het gerapporteerde effect van formamide als het meest efficiënt voor DNA-sjabloon amplificaties tot ongeveer 2,5 kb en verdere ondersteuning van de notie dat DMSO en formamide verbeterd PCR rendement door verschillende mechanismen (s). Ongeacht deze verschillen bleek de toevoeging van BSA aan deze PCR de gunstige effecten die werden waargenomen wanneer een van de twee oplosmiddelen als PCR-toevoegingsmiddel werd gebruikt, verder te bevorderen en uit te breiden. Gezien de potentiële negatieve effecten die hoge concentraties organisch oplosmiddel kunnen hebben op gevoelige downstream-toepassingen zoals sequencing of klonen, is het versterkende effect van de toevoeging van BSA significant. Om inzicht te krijgen in hoe BSA zou kunnen fungeren als een co-enhancer met DMSO of formamide, analyseren we het effect van de toevoeging ervan op amplificatie opbrengst over 10, 15, 20, 25, en 30 cycli van PCR. Deze analyse bevestigde dat toevoeging van DMSO of formamide, maar niet BSA alleen, aan PCR leidt tot verhoging van de opbrengst (figuur 3). Wanneer BSA werd gebruikt als een co-enhancer met DMSO of formamide, een toename van de opbrengst kan worden gedetecteerd in de eerste 15 cycli alleen voor alle templates (figuur 3). Deze toename varieerde van een 10,5% (che1P) toename van de opbrengst tot een 22,7% toename van de opbrengst (cheA1) in de loop van de eerste 15 cycli. Bovendien bleek de effectieve concentratie van BSA toe te nemen met de grootte van het geamplificeerde DNA-fragment tot een maximale BSA-concentratie (10 μg/μl) waarbij geen verdere toename van de opbrengst werd waargenomen. Bovendien werd geen afname van de opbrengst waargenomen, zelfs niet met de grootste concentratie BSA die onder deze omstandigheden werd toegevoegd (figuur 4). Het cyclus-beperkte versterkende effect van BSA op de PCR-opbrengst suggereerde dat dit eiwit na verloop van tijd kan worden gedenatureerd, waardoor het zijn werkzaamheid verliest. Om deze hypothese te testen werd een PCR opgezet waarin DMSO of formamide werd gecombineerd met BSA in de aanvankelijke reactiebuffer bij de meest effectieve concentraties die hierboven zijn bepaald, en 10 cycli uitgevoerd vóór toevoeging van een verse oplossing van BSA (0-10 μg/μl eindconcentratie). BSA toevoeging werd herhaald over 30 PCR-cycli en het effect op de opbrengst werd geanalyseerd zoals hierboven beschreven. Een aanhoudende toename van de opbrengst kon worden gedetecteerd wanneer BSA werd toegevoegd bij elke tiende cyclus van PCR: bijvoorbeeld, in amplificatie van cheA1, een bijna 75% toename van de PCR-opbrengst ten opzichte van die verkregen met oplosmiddel alleen werd verkregen (figuur 4). De resultaten in wat wij de “BSA PCR-stap”-methode noemen, zijn consistent met de veronderstelling dat denaturatie van BSA de daling van het opbrengstverhogende effect na de vijftiende cyclus van PCR veroorzaakt. Controle-experimenten waarbij glycerol of gedestilleerd steriel water bij elke tiende cyclus werd toegevoegd, hebben de PCR-opbrengst niet verhoogd, wat erop wijst dat de effecten van BSA niet te wijten zijn aan een verandering in het reactievolume of aan BSA dat effectief als moleculaire verdringer optreedt, een eigenschap die aan sommige van de effecten van glycerol in PCR wordt toegeschreven. Hoewel de exacte mechanismen van het versterkende effect van BSA op het PCR-rendement niet bekend zijn, ondersteunen de hier verkregen en in de literatuur beschreven gegevens de hypothese dat BSA het DNA-polymerase kan stabiliseren en/of de potentiële remmende effecten van hoge concentraties organische oplosmiddelen op de DNA-polymeraseactiviteit kan tegengaan. Voor de amplificatie van cheA4, het DNA-fragment met het hoogste GC-gehalte dat in deze studie is gebruikt (73%), werd een verhoging van de PCR-opbrengst verkregen door zowel BSA als DMSO aan de PCR toe te voegen, maar er werden ook meerdere niet-specifieke amplificatieproducten gedetecteerd (figuur 5). Om dit probleem op te lossen, werd de BSA PCR-stapmethode vervolgens gebruikt in combinatie met een “Touchdown” PCR-protocol waarvan eerder is aangetoond dat het de PCR-specificiteit verbetert. Deze methode produceerde een enkele specifieke band, en bijna een verdubbeling van de opbrengst die werd geproduceerd door gebruik te maken van de “Touchdown” protocol plus organische oplosmiddelen alleen (96% toename) (figuur 5). Deze resultaten suggereerden ons ook een manier om de relatief lage efficiëntie van het gebruik van hele plasmide site-directed mutagenese methode beschreven in de QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene) te verbeteren om mutatie in sommige GC-rijke DNA-sjabloon (hier de tlp2 gen, een 2,5 kb fragment van 66% GC) te introduceren. Toen we de pUCtlp2 als sjabloon voor gerichte mutagenese, samen met mutagene primers ontworpen om een enkel basenpaar substitutie binnen tlp2 (mutagene primers ontworpen per website van de fabrikant) en het protocol van de fabrikant, de 5,324 kb fragment dat overeenkomt met pUCtlp2 was nauwelijks zichtbaar (figuur 5). Na voltooiing van het mutagenese-protocol volgens de instructies van de fabrikant werden ofwel geen kolonies ofwel een klein aantal kolonies (gemiddeld minder dan 5) verkregen die ouderplasmiden bevatten waarin de gewenste mutatie ontbrak. Dit type resultaat, dat wordt gekenmerkt door een slechte opbrengst van de mutagenese, is eerder erkend als een veel voorkomende valkuil van deze methode. Wanneer echter om de vijf stappen BSA aan de buffer van de fabrikant werd toegevoegd, werd een duidelijk amplificatieproduct gedetecteerd (figuur 5). Na voltooiing van het protocol van de fabrikant werden meer dan 100 kolonies verkregen met 2/3 die de gewenste mutatie droegen (bepaald door sequencing). We hebben ook de BSA PCR stap toegepast in een overlap extension protocol om een chimere eiwit fusie tussen een A. brasilense gen (ATM, 650 bp) en het cyaan fluorescent eiwit (CFP) (720 bp) te construeren. In de overlap-extensie PCR worden eerst 2 sets primerparen gebruikt om twee te fuseren DNA-fragmenten te amplificeren die met een korte overlappende sequentie met elkaar worden geproduceerd. Een derde amplificatie gebruikt de amplificatieproducten van de eerste reacties als templates, samen met de buitenste reverse en forward primers om chimere constructen te genereren . De amplificatie van de eerste twee DNA-fragmenten, ATM en CFP waren zeer efficiënt met behulp van standaard PCR-protocollen en er kon geen significante toename worden verkregen door gebruik te maken van het BSA PCR Step-protocol (gegevens niet weergegeven). De tweede, overlappende PCR-stap, produceerde echter talrijke niet-specifieke amplificatieproducten en weinig of geen gewenst chimeer amplicon (ATM-CFP; tabel 1) (figuur 5). De niet-specifieke amplificatieproducten verdwenen bij gebruik van een “Touchdown” PCR-methode, maar het specifieke gewenste chimere amplicon bleef in zeer geringe hoeveelheid aanwezig, zoals blijkt uit een zeer zwakke ATM-CFP-band van 1.370 bp (figuur 5). Met behulp van de BSA PCR stap methode samen met een “Touchdown” protocol, resulteerde in een 72% toename van de opbrengst van de ATM-CFP chimeer amplicon (figuur 5). Latere klonering en sequenering bevestigden dat het juiste chimere construct is verkregen.
Effecten van DMSO en formamide op de PCR-amplificatie van GC-rijke sjablonen. Typische voorbeelden van de effecten van toevoeging van DMSO en formamide bij verschillende concentraties op de PCR-amplificatie van 2-3 kb GC-rijke DNA-sjablonen. A) Effect van DMSO op de PCR-amplificatie van che1P (boven) en tlp2 (onder), zoals waargenomen door gelelektroforese van de totale PCR-producten. De gels werden gekleurd met ethidiumbromide en gefotografeerd. B) Effect van formamide op de PCR-amplificatie van che1P (boven) en tlp2 (onder) in vergelijkbare experimenten.
PCR-opbrengstverhogend effect van BSA als een co-additief met organische oplosmiddelen wordt gebruikt. Typische voorbeelden van de effecten van BSA als co-additief met DMSO en formamide, bij verschillende concentraties, op de PCR-amplificatie van GC-rijke DNA-sjablonen. A) Effect van DMSO op PCR van che1P (links) en gecombineerd effect van DMSO met 6 μg/μl BSA (rechts), zoals waargenomen door gelelektroforese van het totale PCR-product. B) Effecten van formamide op de PCR-amplificatie van che1P (links) en gecombineerd effect van formamide met 6 μg/μl BSA (rechts) in vergelijkbare experimenten.
Effect van BSA-toevoeging als co-enhancer met organische oplosmiddelen op de PCR-opbrengst. De toename van de PCR-opbrengst wordt uitgedrukt ten opzichte van de PCR-opbrengst die zonder additief is verkregen. Op alle panelen is de volgende legenda van toepassing: rode lijn, alleen DMSO (7,5%); groene lijn, alleen formamide (2,5%); paarse lijn, DMSO (7,5%) en BSA (6 μg/μl); lichtblauw, formamide (2,5%) en BSA (6 μg/μl). A) PCR amplificatie van che1P (392 bp); B) PCR amplificatie van tlp5P (798 bp); C) PCR amplificatie van tlp2 (2.638 bp); D) PCR-amplificatie van cheA1 (3.389 bp); E) PCR-amplificatie van cheOP1 (7.103 bp).
Effect van BSA als co-additief met organische oplosmiddelen bij toevoeging in tussenstappen van de PCR. A) Effect van BSA-toevoeging op het PCR-rendement bij toevoeging om de tien cycli voor DNA-fragmenten met een breed groottebereik (392 bp tot 7.103 bp); B) Representatief voorbeeld van het effect van BSA-toevoeging op de PCR-amplificatie van cheA1 (3.389 bp) in aanwezigheid van DMSO, zoals gedetecteerd door analyse van met gelelektroforese geamplificeerde DNA-fragmenten.
Effect van BSA als co-additief met organische oplosmiddelen bij diverse PCR-toepassingen. A) Een representatief voorbeeld van het effect van BSA-toevoeging (BSA-stap) als co-additief van het effect van DMSO op de PCR-amplificatie van cheA4 in een “Touchdown”-PCR-protocol, zoals gedetecteerd met gelelektroforese. B) Een representatief voorbeeld van het effect van BSA Step-protocol gebruikt bij gerichte mutagenese (QuickChange gerichte mutagenese, Stratagene) PCR-amplificatie van pUCtlp2, zoals aangetoond met gelelektroforese. C) Een representatief voorbeeld van het effect van BSA Step-protocol dat wordt gebruikt in een overlap-extensie-PCR-toepassing, waarbij ATM met CFP wordt gefuseerd om ATM-CFP op te leveren, zoals gedetecteerd door gelelektroforese.