Non-organoïde benaderingen
Tot op heden zijn darmepitheelcellijnen de voornaamste in vitro modelsystemen om intestinale transportprocessen te beoordelen, terwijl enteroendocriene cellijnen gangbare modellen zijn om de secretie van verschillende darmhormonen te bestuderen. Een gevestigd model voor dunne darm enterocyten is de CaCo-2 cellijn (of de CaCo-2 TC7 subkloon), afgeleid van een colon adenocarcinoom. Deze cellijn wordt gewoonlijk gekweekt op transwell platen tot 3 of 4 weken postconfluentie voor studies over intestinaal transport van nutriënten, geneesmiddelen, of andere verbindingen met behulp van radio-gelabelde of fluorescentie-gelabelde substraten (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang en Li, 2017). De HT-29 cellen (en subklonen) zijn een menselijke coloncarcinoom cellijn goed ingeburgerd voor onderzoek naar intestinale transporters, in het bijzonder suikertransporters (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). Om de rol van transporters in intestinale nutrient sensing te bestuderen, zijn echter andere cellijnen nodig. De meest prominente enteroendocriene cellijnen die worden gebruikt voor studies naar darmhormoonsecretie zijn de muriene GLUTag cellijn (Emery et al., 2015), de muriene STC-1 cellijn (Jiang et al., 2016), en de humane NCI-H716 cellijn (Pais et al., 2014). Geen van hen weerspiegelt echter de complexe biologie van entero-endocriene cellen in vivo (Kuhre et al., 2016). Enteroendocriene cellen zijn verspreid over de dunne en dikke darm, en hun expressiepatronen van verschillende darmhormonen verschillen sterk, afhankelijk van hun locatie binnen het darmkanaal (Habib et al., 2012). Zo neemt het aantal GLP-1-secretieve cellen (vaak L-cellen genoemd) geleidelijk toe van de proximale naar de distale darm, terwijl het aantal GIP-secretieve cellen (K-cellen genoemd) afneemt. Entero-endocriene cellijnen, die allemaal van tumoren zijn afgeleid, vormen dus zeer eenvoudige en kunstmatige modelsystemen voor het onderzoek van nutriëntsensors, darmhormoonsecretie, en de onderliggende moleculaire en regulatorische mechanismen. Het voordeel van zoogdiercellijnen is dat zij door talrijke laboratoria over de gehele wereld goed zijn ingeburgerd. Er zijn veel wetenschappelijke gegevens beschikbaar, evenals gevestigde experimentele protocollen. Bovendien zijn ze gemakkelijk te hanteren en is de kweek goedkoop. Toch zijn al deze cellijnen zeer eenvoudige en kunstmatige modelsystemen. Zij zijn meestal afkomstig van tumoren en vertegenwoordigen slechts één enkel celtype, hetgeen niet overeenkomt met de complexiteit van het darmslijmvlies, dat uit meerdere gespecialiseerde celtypes bestaat. Ook zijn ze meestal gekweekt in twee-dimensies, die niet de driedimensionale architectuur van de inheemse darm weer te geven.
In het bijzonder voor studies over nutriënten sensing en darm hormoon secretie, primaire darm celkweek is een veel betere aanpak, en is vastgesteld als een betrouwbaar model in de afgelopen jaren (Reimann et al., 2008). Primaire culturen gekweekt uit geïsoleerde darmcrypten hebben het voordeel dat ze kunnen worden gegenereerd uit verschillende darmsegmenten (Parker et al., 2012), en uit muizen (wild-type of knock-out dieren) (Diakogiannaki et al., 2013), of mensen (Habib et al., 2013). Zij omvatten absorberende enterocyten, alsook verschillende subtypes van entero-endocriene cellen, zoals aangetroffen in de inheemse darm. Deze culturen bevatten echter slecht gedifferentieerde enterocyten, en zijn daarom niet geschikt voor de detectie van intestinale transporters en receptoren op eiwit- of functioneel niveau. Zij zijn een korte-termijnkweeksysteem dat niet geschikt is voor experimenten op lange termijn, en kunnen niet worden gepasseerd, waardoor het aantal proefdieren dat voor de kweekvoorbereiding nodig is, toeneemt. Hetzelfde is het geval voor geïsoleerde darmepitheelcellen (Grossmann et al., 1998), die alle mucosale celtypen omvatten, maar een zeer beperkte levensvatbaarheid in vitro vertonen, en geen intact epitheel vertegenwoordigen.
Korte-termijn stabiliteit is ook een beperking van weefselexplantaten, zoals everted gut ringen (Roder et al., 2014), of darmzakken uit de darm van muizen of ratten (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016) die vaak worden gebruikt voor transportstudies. Geëtste darmringen kunnen in vitro worden geïncubeerd met gelabelde substraten, of kunnen worden geprepareerd na orale toediening van bijvoorbeeld radio-gelabelde transporter substraten bij knaagdieren (Roder et al., 2014). Everted darmzakken kunnen zelfs worden gebruikt voor flux studies, aangezien de luminale en basolaterale compartimenten afzonderlijk kunnen worden gericht. Voorbereiding en behandeling zijn echter niet triviaal, en vereisen enige ervaring. Het voordeel van weefsel explanten is dat ze kunnen worden bereid uit verschillende darmsegmenten, en hun regio-specifieke in vivo kenmerken worden bewaard in vitro. De intestinale explant behoudt zijn oorspronkelijke architectuur, en de mucosa is verbonden met het omliggende weefsel zoals submucosa of spieren, en neuronen, lymfe, bloedvaten zijn inbegrepen. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraagstelling kan dit een voordeel of een nadeel zijn. Intestinale sensing van voedingsstoffen en daaropvolgende darmhormoonsecretie wordt soms onderzocht in geperfundeerde knaagdierendarm (Kuhre et al., 2015). Het dier wordt onder narcose gebracht en het darmlumen wordt ex vivo doorbloed met de vermeende stimulantia. De basolaterale vloeistof wordt verzameld, en de darmhormooninhoud wordt geanalyseerd. Deze techniek is technisch niet gemakkelijk, en ethische hindernissen beperken het brede gebruik van deze methode voor studies over door nutriënten geïnduceerde afgifte van darmhormonen.
Een betrouwbaar en beproefd model dat wordt gebruikt voor studies over functionele kenmerken en regulering van intestinale transporters is heterologe expressie in Xenopus laevis oocyten (Hirsch et al., 1996). Na mRNA-injectie wordt het eiwit van interesse tot expressie gebracht in de oöcyt, en de transportkinetiek kan worden onderzocht met behulp van radioactief gelabelde substraten of elektrofysiologische benaderingen in het geval van elektrogene transporters (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Deze techniek is een uitstekend hulpmiddel om functionele kenmerken van één bepaalde transporter te bestuderen, hoewel het doeleiwit zich in een kunstmatige omgeving bevindt en er geen regulerende factoren aanwezig zijn, zoals dat in de zoogdiercel het geval zou zijn. Bovendien zijn de beschikbaarheid van intacte oöcyten en de gecompliceerde behandeling, waaronder de injectie van oöcyten, kritieke punten die bij de toepassing van deze techniek in aanmerking moeten worden genomen. Veel gemakkelijker heterologe expressiesystemen zijn gist en E. coli. Zij maken het mogelijk recombinante mutanten te genereren die, eenmaal gegenereerd, op grotere schaal kunnen worden gekweekt of gefermenteerd, waardoor grote hoeveelheden eiwit kunnen worden geproduceerd. Hoewel deze micro-organismen goedkoop en gemakkelijk te hanteren zijn, zijn zij zeer vereenvoudigde modelsystemen voor het onderzoek van eiwitten van zoogdieren, en met name van grote membraaneiwitten. Problemen die zich vaak voordoen zijn misvouwing van het eiwit, of mislukte membraaninsertie. Daarom zijn deze systemen eerder nuttig voor de structurele karakterisering van gezuiverde eiwitten of eiwitdomeinen (Beale et al., 2015) dan voor gedetailleerde studies van de functie en regulering van zoogdiereiwitten.
Nieuwe en veelbelovende benaderingen die in het zeer recente verleden tot stand zijn gekomen, zijn driedimensionale zoogdiercelcultuurmodellen. Intestinale cellijnen zoals CaCo-2 of HT-29 worden gekweekt op scaffolds, waardoor een meer darmachtige architectuur ontstaat die leidt tot een betere differentiatie (Chen et al., 2015). Andere driedimensionale modellen worden rechtstreeks gekweekt uit menselijke dunne darm epitheelcellen en myofibroblasten op gecoate microporeuze membranen (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b), en kunnen niet in vitro worden vermenigvuldigd. Deze modellen kunnen worden opgezet voor transportstudies van voedingsstoffen of geneesmiddelen, en culturen gekweekt uit menselijke darmepitheelcellen omvatten zelfs verschillende mucosale celtypes, maar geen enteroendocriene cellen. Hetzelfde geldt voor driedimensionale bioprinting van weefsels, een andere technologie die zeer recent is ontstaan en enorm in de belangstelling is komen te staan. Deze benadering is van meer waarde voor regeneratieve geneeskunde en transplantatie dan voor experimenteel onderzoek (Murphy en Atala, 2014). Bioprinting van verschillende weefsels, waaronder hart, huid en botten, is met succes tot stand gekomen, maar bioprinting van darmweefsels is tot op heden zeldzaam en moet verder worden verbeterd (Wengerter et al., 2016).