In onze studie, hebben wij retrospectief de aanwezigheid van CALR mutaties gedetecteerd in een cohort van 524 JAK2 V617F-negatieve patiënten die zich presenteerden met klinische en/of laboratoriumverdenking van MPN met als hoofddoel de diagnostische waarde van deze detectie te bepalen. Gedurende de geobserveerde periode werden CALR-mutaties in ons centrum niet routinematig onderzocht bij patiënten met verdenking op MPN, omdat ze pas recent ontdekt zijn1,2. De JAK2 V617F mutatie daarentegen wordt al routinematig geanalyseerd sinds de ontdekking ervan in 200520. Daarom werden JAK2 V617F-positieve patiënten van het onderzoek uitgesloten. Een MPL-mutatie is een relatief zeldzame bevinding bij MPN-patiënten en komt meestal voor bij patiënten met hetzij ET, hetzij PMF21. In ons laboratorium werden MPL-tests pas onlangs opgenomen in het diagnostische algoritme bij patiënten met verdenking op MPN en ze worden pas uitgevoerd na uitsluiting van JAK2 V617F- en CALR-mutaties. Daarom werd de MPL-status niet bij al onze patiënten bepaald op het ogenblik van het eerste onderzoek.
Ons centrum is een universitair medisch ziekenhuis dat een gebied met ongeveer 1.000.000 inwoners bedient en een verwijscentrum is voor hematologische maligniteiten. Alle patiënten die naar de afdeling hematologie werden verwezen, werden eerst beoordeeld door huisartsen zonder gedetailleerde kennis op het gebied van hematologische maligniteiten. Zoals weergegeven in tabel 3 had slechts een deel van de patiënten die naar de afdeling hematologie werden verwezen pathologische klinische en/of laboratoriumparameters die verdacht waren voor MPN op het moment van het eerste onderzoek. Daarom waren de meeste patiënten die naar de afdeling Hematologie werden doorverwezen personen zonder hematologische maligniteit, aangezien wij hebben vastgesteld dat 380 patiënten (380/524 = 72,5%) MPN-vrij waren. Deze patiënten werden gediagnosticeerd met secundaire veranderingen in het perifere bloedgehalte veroorzaakt door verschillende aandoeningen, zoals ijzertekort, infectie- en ontstekingsziekten, hyposplenisme, maligniteit, roken, recente chirurgie, gebruik van corticosteroïden en chronische hypoxie. Het aantal CALR-positieve patiënten in ons cohort was dan ook laag. Wij identificeerden 4,4% van de patiënten die verdacht werden van MPN als CALR-positief, van wie de meesten gediagnosticeerd werden met ET of PMF. De meeste vergelijkbare studies analyseerden het aantal CALR-positieve patiënten met bevestigde MPN; het aantal CALR-positieve patiënten was dus veel hoger, variërend van 12 tot meer dan 20%22,23,24,25,26. Op basis van onze gegevens zou het nuttig zijn de diagnostische benadering van patiënten met verhoogde niveaus van één of meer bloedcellijnen te verbeteren, aangezien dit in de meeste gevallen niet veroorzaakt wordt door hematologische maligniteit. Patiënten moeten routinematig worden gescreend op de meest voorkomende oorzaken van secundaire erytrocytose, trombocytose en leukocytose, en het bloedbeeld moet ten minste eenmaal bij vervolgbezoeken worden herhaald alvorens te worden doorverwezen naar de afdeling hematologie. Moleculair genetisch onderzoek moet worden voorbehouden aan patiënten met een hoge verdenking op een klonale hematologische ziekte en niet worden uitgevoerd bij alle patiënten die naar de afdeling hematologie worden verwezen.
CALR-mutaties worden vaak geïdentificeerd bij JAK2 V617F-negatieve patiënten met ET1,2. In ons centrum werd slechts bij een minderheid van de CALR-positieve patiënten (7/23 = 30%) op het moment van het eerste onderzoek de diagnose ET gesteld volgens de WHO-criteria van 2008. De belangrijkste reden hiervoor was de relatieve terughoudendheid ten aanzien van beenmergonderzoek bij patiënten met matige trombocytose en een laag risico op trombotische complicaties. Dit betekent echter dat wij het aantal patiënten met klonale trombocytose onderschat kunnen hebben. Door de aanwezigheid van CALR-mutaties te bevestigen, waren wij in staat om retrospectief bij 9 patiënten de diagnose ET te stellen volgens de gewijzigde WHO-criteria voor ET13. Hoewel al deze patiënten follow-up kregen op onze afdeling wegens hoge verdenking op klonale trombocytose, is het van groot prognostisch en therapeutisch voordeel om de diagnose ET te kunnen bevestigen met een niet-invasieve procedure zoals moleculair-genetische testen. CALR-mutaties zijn daarom belangrijke diagnostische kenmerken voor ET, zoals ook recent in de literatuur is bevestigd27,28.
Alle patiënten met PMF werden gediagnosticeerd volgens de WHO-criteria op het moment van het onderzoek op de afdeling Hematologie. Identificatie van CALR-mutaties bevestigde retrospectief de diagnose, maar had geen directe diagnostische of therapeutische gevolgen.
CMML is een subtype van MDSs/MPNs en niet strikt MPNs12. CALR-mutaties bij patiënten met CMML zijn uiterst zeldzaam en spelen geen belangrijke rol in de pathogenese ervan. Uit een groepsstudie van Zamora et al. bleek dat bij slechts 1 van de 174 patiënten met CMML een CALR-mutatie werd gevonden29. De patiënt in onze studie bij wie CMML type één werd gediagnosticeerd en die later overging naar myelofibrose, is bij het eerste onderzoek mogelijk verkeerd gediagnosticeerd, omdat PMF en CMML veel gemeenschappelijke kenmerken hebben, waaronder monocytose en beenmergfibrose. In een recente studie van Hu et al. konden veel patiënten bij wie CMML was gediagnosticeerd, na een nauwkeuriger analyse worden geherclassificeerd als patiënten met PMF, waaruit blijkt dat een grondiger analyse moet worden uitgevoerd om een nauwkeurige diagnose te stellen, vooral bij patiënten met moleculaire biomarkers die typisch zijn voor ET/PMF11,30.
Er zijn meer dan 50 frameshift CALR-mutaties beschreven, die zich alle in exon 9 van het CALR-gen bevinden. Er zijn twee hoofdtypen CALR-mutaties: type 1 (een 52-bp deletie; p.L367fs*46) en type 2 (een 5-bp TTGTC insertie; p.K385fs*47). Op basis van hun moleculaire kenmerken kunnen andere mutaties worden gegroepeerd als type 1-achtige en type 2-achtige31. In onze studie was het meest voorkomende type CALR-mutatie type 1, wat overeenkomt met de gegevens uit de literatuur2,16,32. Mutaties die noch type 1, noch type 2 zijn, moeten als type 1-achtig of type 2-achtig worden ingedeeld, aangezien dit van invloed kan zijn op het klinische fenotype en, in het geval van PMF, zelfs op de overleving17. De type 1- en type 2-achtige mutaties in onze studie werden gedefinieerd met behulp van AGADIR15, een statistisch benaderingsalgoritme dat de helixgeneigdheid berekent voor de 31 unieke aminozuursequenties die door CALR-mutaties worden gewijzigd16. Dit algoritme is in soortgelijke studies gebruikt en is een belangrijk hulpmiddel bij de subclassificatie van CALR-mutaties16,17. Het lijkt uiterst belangrijk het type CALR-mutatie goed te definiëren, aangezien dit ook van invloed is op de diagnose. Het is bekend dat alleen mutaties die tot een + 1 (-1 + 2) frameshift van het leesraam leiden pathogeen zijn6. Andere CALR-mutaties kunnen kiembaanvarianten van CALR zijn met een onbekende klinische betekenis. In onze studie werden bij twee patiënten niet-frameshift CALR-mutaties gevonden. Bij één van deze patiënten werd op het moment van onderzoek op de afdeling Hematologie reactieve trombocytose gediagnosticeerd en deze werd retrospectief als CALR-positief gedefinieerd. Een gedetailleerde analyse bevestigde een missense CALR-mutatie die resulteert in de substitutie van glutaminezuur door asparaginezuur op aminozuurpositie 398. Dezelfde mutatie werd ontdekt bij een patiënt met door de WHO gedefinieerde chronische neutrofiele leukemie (CNL) in een studie van Lasho et al. Zijn studie concludeerde dat CALR-mutaties die niet resulteren in het ontstaan van een aparte C-terminus, wijzen op een ander pathogeen mechanisme dat wellicht nog onbekend is33. In onze studie gingen wij ervan uit dat onze patiënte geen CALR mutatie had ontwikkeld die een klonale hematologische ziekte zou impliceren. Op grond van de voorgeschiedenis van de patiënte, het klinisch onderzoek en de laboratoriumbevindingen, was er vooral een suggestie van reactieve trombocytose. Op het moment van het schrijven van dit artikel was de patiënt in goede gezondheid zonder mogelijke complicaties geassocieerd met een klonale hematologische ziekte.
Een andere patiënt met een niet-frameshift CALR mutatie werd gediagnosticeerd met MPN-U. Deze patiënte droeg een germline in-frame deletie in het CALR-gen (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), die reeds was herkend bij een symptomatische patiënte met MPN34. Hoewel het KDEL motief behouden bleef, leidde de deletie van één aminozuur (p.(Glu381del)) tot de wijziging van de secundaire structuur van het eiwit evenals van de driedimensionale structuur, hetgeen leidde tot de conclusie van de pathogene aard van deze in-frame deletie23,34,35. Onze patiënt met MPN-U werd helaas niet meer opgevolgd, en een exacte hematologische diagnose of mogelijke complicaties konden niet worden vastgesteld. De laboratoriumresultaten waren echter suggestief voor een klonale hematologische ziekte.
In onze studie ontdekten wij vier nieuwe CALR mutaties in exon 9 die, voor zover ons bekend, nog niet zijn geregistreerd in de COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) of HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk) database. De COSMIC-databank is ’s werelds grootste door deskundigen samengestelde databank van somatische mutaties bij kanker bij de mens. Zij beschrijft meer dan 4 miljoen coderende mutaties36. De HGMD-databank is een poging om alle bekende (gepubliceerde) genletsels die verantwoordelijk zijn voor erfelijke ziekten bij de mens te collationeren19. De nieuwe mutaties die in onze studie werden vastgesteld zijn NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.11541154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), en NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Al deze mutaties waren type 2-achtige mutaties.
ET en PMF worden geassocieerd met een verhoogd risico op trombotische en trombo-embolische voorvallen, die belangrijke oorzaken van morbiditeit en mortaliteit vormen37. Vermindering van het risico op trombotische en trombo-embolische complicaties is een van de belangrijkste doelstellingen van de behandeling, vooral bij patiënten met ET38. Deze patiënten lopen ook een hoger risico op bloedingscomplicaties, die verband kunnen houden met complicaties van de behandeling of het verworven von Willebrand syndroom (AVWS) als gevolg van extreme trombocytose (bloedplaatjes > 1000 × 109/L)28,39,40. Het risico op trombose bij patiënten met ET bedraagt meer dan 20%41. In een Zweeds onderzoek ontwikkelde 35% van de patiënten met ET vasculaire complicaties42. Bij PMF komen trombotische voorvallen ongeveer even vaak voor als bij ET43. De prevalentie voor trombotische complicaties bij patiënten met PMF varieert van 7 tot 30%44,45,46. In onze studie was de prevalentie van trombotische complicaties bij CALR-positieve patiënten 30%. Drie patiënten hadden echter een trombotische complicatie ontwikkeld meer dan 10 jaar voordat de diagnose MPN werd vermoed. De werkelijke prevalentie van trombotische complicaties in onze studie was daarom lager. Eén patiënt ontwikkelde een glasvochtbloeding die het gevolg was van een inadequate antistollingstherapie met warfarine. Geen van de twee patiënten met een bloedingscomplicatie had extreme trombocytose op het moment van de complicatie. Vergeleken met JAK2 V617F en MPL mutaties, is CALR een gunstige mutatie en wordt geassocieerd met een lagere incidentie van trombotische voorvallen1,2,47. Bij de meeste CALR-positieve patiënten die trombo-hemorragische complicaties ontwikkelden, werden type 1-mutaties gevonden (71,4%). Zoals reeds aangetoond, hadden patiënten met type 1-achtige mutaties een hoger risico op trombose in vergelijking met patiënten met type 2-achtige mutaties10.
CALR-mutaties zijn momenteel bekend als een van de drie belangrijkste mutatietypes, naast JAK2 V617F en de MPL-mutatie, bij patiënten met ET of PMF. Er waren echter nog 10-15% van de patiënten met ET of PMF met een onbekende moleculaire genetische marker die aan de ziekte ten grondslag ligt. Deze patiënten worden “triple negatief” genoemd48. Bij deze patiënten is gezocht naar nieuwe moleculaire biomarkers door sequentiebepaling van coderende exonen in myeloïde kankergenen, hetgeen veelbelovende resultaten heeft opgeleverd. Dit kan een gepersonaliseerde benadering van de diagnose bij patiënten met MPN opleveren49.
CALR-mutaties bij MPN-patiënten worden ook onderzocht op hun therapeutisch potentieel50,51,52. CALR exon 9 mutaties zouden doelwitten kunnen zijn voor immuuntherapie tegen kanker, aangezien is aangetoond dat zij als immunogene neo-antigenen fungeren51. Bij de behandeling van MPN zou het nuttig kunnen zijn om CALR-vaccins te combineren met immunomodulerende behandelingen53 zoals interferon-alfa (IFN-α)54 of programmed death 1 ligand (PD-L1)55 als een combinatorische kankervaccinatie53. CALR-mutaties zijn niet alleen belangrijke diagnostische en prognostische markers bij patiënten met MPN, maar zouden in de toekomst ook een belangrijk therapeutisch doelwit kunnen worden in een subgroep van patiënten met MPN.