H. hepaticus-gedreven ontsteking verandert het intestinale mononucleaire fagocytencompartiment
De Gram-negatieve bacterie Helicobacter hepaticus (Hh) is een niet-invasief organisme dat gewoonlijk wordt aangetroffen in de mucosale laag van het lagere darmkanaal van muizen. Wild-type dieren geïnfecteerd met de bacterie ontwikkelen geen intestinale immunopathologie en dienen als dragers van de infectie.21 Muizen met genetische deficiënties in de IL-10/IL-10R pathway zijn echter gevoelig voor experimentele Hh infectie en ontwikkelen ernstige ontsteking van het colon en cecum (typhlocolitis) geassocieerd met epitheliale hyperplasie.22, 23 Ook Hh infectie van wild-type muizen met gelijktijdige toediening van anti-IL-10R monoklonale antilichamen (mAbs) triggert IL-23-afhankelijke darmontsteking samen met een robuuste T helper type 1/type 17 (Th1/Th17)-gepolariseerde effector T cel respons.23 Muizen geïnfecteerd met Hh en behandeld met anti-IL-10R antilichamen, maar niet niet-geïnfecteerde of enkelvoudig behandelde controles, ontwikkelen histologische kenmerken van colitis binnen 2-3 weken na infectie (Figuur 1a). Hh en anti-IL-10R behandelde muizen vertonen verder een duidelijke infiltratie van leukocyten in de lamina propria (figuur 1b), met inbegrip van overheersende populaties van neutrofielen en MHCII + monocyten (figuur 1c en Supplementary Figure S1a online). In het niet-ontstoken colon, monocyten invoeren van de lamina propria uit het bloed bij voorkeur aanleiding geven tot weefsel macrofagen 11 (gedefinieerd als CD11b + CX3CR1hi Ly6Clo cellen, groene subset), tot expressie brengen van hoge niveaus van CD64, MHCII, F4/80 en CD11c (figuur 1d en Supplementary Figure S1b). Dit proces wordt echter drastisch veranderd tijdens ontsteking en we zagen de duidelijke accumulatie van MHCII + monocyten (gedefinieerd als CD11b + CX3CR1int Ly6Chi cellen, rode subset) binnen de colon lamina propria. Deze cellen worden gekenmerkt door de expressie van CD64 en MHCII en intermediaire niveaus van F4/80, CD24, en CD11c (figuur 1c-e en supplementaire figuur S1a). Bij steady state, MHCII + monocyten en macrofagen tot expressie brengen de mannose receptor (CD206), een marker geassocieerd met anti-inflammatoire macrofaag functie.24 Echter, expressie van CD206 was lager in MHCII + monocyten en macrofagen tijdens colitis (figuur 1f), wat suggereert dat niet alleen monocyt maar ook macrofaag functies werden gewijzigd tijdens ontsteking. Inderdaad vonden we dat tijdens ontsteking, MHCII + monocyten uitgedrukt hogere hoeveelheden tumor necrose factor-α en IL-6 eiwit, en Nos2 (induceerbare stikstofmonoxide synthase) mRNA, en dat IL-6 was ook verhoogd in macrofagen (Supplementary Figure S1c). IL-10 productie door zowel MHCII + monocyten en macrofagen was ook verhoogd tijdens de ontsteking (Supplementary Figure S1c), waarschijnlijk als gevolg van een ontsteking-gedreven negatieve feedback pathway.
Helicobacter hepaticus (Hh)-gedreven ontsteking verandert de intestinale mononucleaire fagocyten compartiment. CX3CR1GFP/+ muizen werden geïnfecteerd met Hh en behandeld met anti-IL-10R monoklonaal antilichaam (mAb), of met de respectievelijke enkelvoudige controles zoals aangegeven, en werden vergeleken met niet-geïnfecteerde controles (Ctrl). Muizen werden na 2-3 weken geanalyseerd. (a) Colon histopathologie scores. (b) Totaal aantal colon lamina propria cellen per muis. (c) Frequentie van myeloïde cel subsets onder de totale colon CD11b + leukocyten. (d) Representatieve fluorescentie-geactiveerde cell sorting (FACS) plots en (e) histogrammen van de aangegeven myeloïde subsets: MHCII + monocyten (CD11b + CX3CR1int Ly6Chi, rode subset), macrofagen (CD11b + CX3CR1hi Ly6Clo cellen, groene subset), CD11b + DC’s (CD11c + CD103- CD11b + CX3CR1int cellen, grijze subset), en CD103 + DC’s (CD11c + CD103 + CX3CR1- cellen, oranje subset). Alle cellen werden voorgegoten op levende CD45+ leukocyten, met uitzondering van neutrofielen en eosinofielen. Fluorescentie min één (FMO) controles voor CD11b + MHCII + cellen worden getoond. (f) Frequentie van CD206+ cellen onder de aangegeven subsets bepaald door flowcytometrie. De datapunten vertegenwoordigen individuele muizen, de balken geven de medianen aan. Alle gegevens zijn representatief voor ten minste twee onafhankelijke experimenten. **P<0.01, ***P<0.001 zoals bepaald door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Bonferroni’s post-test. DC, dendritische cel; IL-10, interleukine-10; LPL, lamina propria leukocyte.
PowerPoint slide
Naast hun differentiatie in macrofagen, is ook aangetoond dat MHCII+ monocyten differentiëren in een Ly6Clo CX3CR1int heterogene subset die verwant is aan zowel macrofagen als klassieke DCs.11 Onder dit heterogene compartiment kunnen CD11b+ DCs (gedefinieerd als CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int cellen, grijze subset) gemakkelijk onderscheiden worden van macrofagen onder homeostatische condities. CD11b + DCs uitdrukken MHCII, CD24, en CD11c, maar niet expressie van CD64 en F4/80, markers vaak geassocieerd met macrofagen (figuur 1d en aanvullende figuur S1b). Echter, het onderscheid tussen macrofagen en CD11b + DC’s werd vervaagd tijdens de ontsteking door het verschijnen van een CD64-expressie populatie (figuur 1d, e) en het is momenteel onduidelijk hoe deze cellen ontogenetisch en functioneel betrekking hebben op steady-state macrofagen of CD11b + DC’s.
Tijdens colitis, de duidelijke accumulatie van MHCII + monocyten gecorreleerd met een verminderde frequentie van macrofagen, CD11b + DC’s, en CD103 + DC’s (gedefinieerd als CD11c + CD103 + CX3CR1-cellen, oranje subset) onder CD45 + lamina propria-cellen (figuur 1c,d). De absolute aantallen toonden echter een kleine toename van CD11b+ DC’s en CD103+ CD11b+ DC’s. Daarentegen bleven de aantallen macrofagen onveranderd en CD103+ CD11b- DCs waren licht afgenomen (Supplementary Figure S1a).
Al met al, Hh infectie in de aanwezigheid van IL-10R blokkade triggers intestinale ontsteking geassocieerd met dramatische veranderingen in het myeloïde compartiment. We zagen een overheersende accumulatie van granulocyten en MHCII+ monocyten in de colon lamina propria. Bovendien kregen MHCII+ monocyten en macrofagen een meer pro-inflammatoir profiel.
CD11c+ mononucleaire fagocyten drijven colitis aan door de productie van IL-23
Omdat IL-23 geïdentificeerd is als de belangrijkste drijfveer van colitis in dit model,23 onderzochten wij vervolgens de functionele relevantie van IL-23 productie door mononucleaire fagocyten in de ontwikkeling van colitis in het Hh+anti-IL-10R model. Daarom kruisten we muizen die groen fluorescerend eiwit (GFP) en Cre recombinase tot expressie brengen onder controle van de CD11c promoter (gecodeerd door Itgax)25, 26 met muizen die twee loxP sites bezitten die vier exonen van het Il23a gen flankeren27 om Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-) muizen te genereren.
Als CD11cIL-23- muizen uitdrukken GFP onder de controle van de CD11c promotor en kan daarom niet worden gekruist met CX3CR1-GFP reporter muizen, we vertrouwden op een alternatieve gating strategie om de myeloïde compartiment in deze muizen (Supplementary Figuur S2) te beoordelen. Bij steady state, CD11cIL-23- muizen hadden vergelijkbare aantallen leukocyten in de dikke darm als hun IL-23-proficiënte nestgenoten (CD11cIL-23 +) (Supplementair Figuur S3a) en geen significante veranderingen in de frequenties van myeloïde of T-cellen werden waargenomen (Supplementair Figuur S3b). Echter, zoals IL-23 is vereist voor het behoud van gedifferentieerde Th17 cellen,28 CD11cIL-23- muizen vertoonden sterk verminderde niveaus van IL-17 + en IL-17 + IFNγ + CD4 + T-cellen in de dikke darm (Supplementaire figuur S3c).
Na infectie met Hh en anti-IL-10R behandeling, vertoonden CD11cIL-23- muizen een opvallende vermindering van colitis in vergelijking met CD11cIL-23+ muizen, met verminderde epitheliale crypte hyperplasie en lagere leukocyten infiltratie in de hele dikke darm en blindedarm (figuur 2a,b). CD11cIL-23- muizen vertoonden ook geen ontwikkeling van splenomegalie (Figuur 2c), wat erop wijst dat ze ook beschermd waren tegen systemische tekenen van ziekte. Verminderde pathologie waargenomen in CD11cIL-23- muizen was niet een gevolg van een differentiële bacteriële belasting, zoals Hh kolonisatie niveaus waren vergelijkbaar in CD11cIL-23- en CD11cIL-23 + groepen (figuur 2d). In overeenstemming met verminderde pathologische veranderingen, werden zowel aangeboren als adaptieve effector cytokines sterk verminderd in de dikke darm van CD11cIL-23- muizen na Hh en IL-10R blokkade (figuur 2e), evenals de hoeveelheid IL-23 zelf (figuur 2f).
Interleukine-23 (IL-23) van CD11c+ cellen stuurt Helicobacter hepaticus (Hh)-geïnduceerde colitis aan. CD11cIL-23+ en CD11cIL-23- muizen werden geïnfecteerd met Hh gecombineerd met anti-IL-10R monoklonaal antilichaam (mAb) behandeling en geanalyseerd na 3 weken. Niet-geïnfecteerde muizen dienden als controle. (a) Representatieve microfoto’s van hematoxyline en eosine-gekleurde secties (bar-200 urn) en histopathologie scores van de dikke darm en blindedarm. (b) Totaal aantal lamina propria cellen per muis. (c) Milt gewicht. (d) Hh kolonisatieniveau gekwantificeerd door kwantitatieve PCR (qPCR). (e,f) Expressie van cytokines beoordeeld door (e) multiplex flowcytometrische assay of (f) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) op de supernatanten van niet-gestimuleerde lamina propria cellen gekweekt gedurende 48 h. Datapunten vertegenwoordigen individuele muizen, balken geven medianen aan. Gegevens zijn samengevoegd van twee onafhankelijke experimenten en zijn representatief voor vier experimenten. **P<0,01, ***P<0,001 zoals bepaald door (a-c) een-wegs variantieanalyse (ANOVA) met Bonferroni’s post-test of (d-f) Mann-Whitney U-test. IFNγ, interferon-γ; TNFα, tumornecrosefactor-α.
PowerPoint slide
In overeenstemming met hun verminderde leukocyten infiltratie, CD11cIL-23- muizen toonden een verminderde frequentie en aantal van zowel MHCII- en MHCII + monocyten (Figuur 3a) en neutrofielen (Supplementary Figure S3d) binnen de lamina propria na Hh infectie en IL-10R blokkade in vergelijking met vergelijkbaar behandelde CD11cIL-23 + nestgenoten. De lagere infiltratie van monocyten in CD11cIL-23- muizen correleerde met een hogere frequentie van lamina propria macrofagen, terwijl de frequenties van CD11b+ DCs en CD103+ DCs onveranderd waren en de absolute aantallen waren verminderd (Supplementaire Figuur S3d).
MHCII+ monocyten en pathogene T-cellen zijn verminderd in Helicobacter hepaticus (Hh)-geïnfecteerde en anti-IL-10R-behandelde CD11cIL-23- muizen. CD11cIL-23+ en CD11cIL-23- muizen werden geïnfecteerd met Hh gecombineerd met anti-IL-10R monoklonaal antilichaam (mAb) behandeling en geanalyseerd na 3 weken. (a) Representatieve fluorescentie-geactiveerde cell sorting (FACS) plots, frequenties onder CD45 + leukocyten, en absolute aantallen van de aangegeven myeloïde subsets in de colon lamina propria. (b) Frequenties van CD4 + T-cellen onder CD45 + leukocyten. (c) Representatieve FACS plots en frequenties van IFNγ +, IFNγ + IL-17A +, en IL-17A + cellen onder CD4 + T-cellen na stimulatie met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) en ionomycine. De datapunten vertegenwoordigen individuele muizen, de balken geven de medianen aan. De gegevens zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. *P<0.05, **P<0.01 zoals bepaald door Mann-Whitney U-test. IFNγ, interferon-γ; IL, interleukine; MHCII, major histocompatibility complex class II; TCR, T-celreceptor.
PowerPoint slide
Omdat IL-23 darmontsteking aanwakkert door directe effecten op T-cellen, waardoor hun accumulatie en proliferatie in de dikke darm wordt bevorderd,29 onderzochten wij het colon T-cel compartiment van CD11cIL-23- en CD11cIL-23+ muizen tijdens colitis. CD11cIL-23- muizen vertoonden lagere frequenties van colon CD4+ T-cellen in vergelijking met hun IL-23-proficiënte nestgenoten (Figuur 3b). Terwijl CD11cIL-23+ muizen een robuuste Th1/Th17 effectorrespons opbouwden, gekenmerkt door de opkomst van enkel- en dubbelproducerende IL-17A+/IFNγ+ T-cellen, vertoonden CD11cIL-23- muizen slechts een milde inductie van de overeenkomstige cytokines (Figuur 3c).
Over het geheel genomen wijst de afwezigheid van colitis bij CD11cIL-23- muizen erop dat de productie van IL-23 door CD11c-expresserende MNP’s een niet overheersende rol speelt in de intestinale ontstekingsreactie.
MHCII+ monocyten en macrofagen zijn de voornaamste bron van IL-23 bij H. hepaticus infectie
Om de opeenvolging van gebeurtenissen geassocieerd met de ontwikkeling van colitis in IL-23-proficiënte muizen beter te begrijpen, controleerden we eerst de IL-23 expressie in leukocyten gezuiverd van de colon lamina propria. Il23a mRNA expressie was consequent detecteerbaar 4-5 dagen na aanvang van colitis (Figuur 4a), wat suggereert dat een weefsel-residente en/of een snel gemobiliseerde cellulaire subset betrokken is bij de vroege productie van IL-23 in de dikke darm. Daarom kozen wij dit tijdstip voor verdere analyses. Op 4 dagen na infectie met Hh en anti-IL-10R behandeling, vertoonden CD11cIL-23+ muizen een verhoogde infiltratie van leukocyten in de lamina propria ten opzichte van niet-geïnfecteerde controle muizen (Figuur 4b). Deze instroom gecorreleerd met verhoogde aantallen van alle MNP subsets in de dikke darm (Supplementair Figuur S4a,b), evenals verhoogde frequenties van zowel MHCII- en MHCII + monocyten (figuur 4c,d), neutrofielen (figuur 4d), CD103 + CD11b- DCs, en CD103 + CD11b + DCs (figuur 4e). De frequenties van macrofagen en CD11b+ DC’s onder de totale leukocyten waren echter onveranderd op dit tijdstip (figuur 4d).
MHCII+ monocyten en macrofagen zijn de belangrijkste producenten van interleukine-23 (IL-23) tijdens Helicobacter hepaticus (Hh)-geïnduceerde colitis. CD11cIL-23+ muizen (Cre-GFP+) werden geïnfecteerd met Hh gecombineerd met anti-IL-10R monoklonaal antilichaam (mAb) behandeling en 4 dagen na infectie geanalyseerd naast niet-geïnfecteerde controles (Ctrl). (a) Kwantitatieve PCR (qPCR) analyse van Il23a mRNA expressie in colon weefsel verzameld van vijf individuele muizen op de aangegeven tijdstippen. (b) Totaal aantal lamina propria cellen per muis op dag 4. (c) Vertegenwoordiger fluorescentie-geactiveerde cell sorting (FACS) plots en (d,e) frequenties van de aangegeven myeloïde subsets (zoals gedefinieerd in supplementaire figuur S2) onder colon CD45 + leukocyten. (f,g) Representatieve FACS plots van CD11c-Cre-geassocieerde groen fluorescent eiwit (GFP) expressie vs (f) CD11c en (g) MHCII. (h) qPCR analyse van Il23a mRNA expressie door Cre-GFP + en Cre-GFP- cellen FACS-gesorteerd uit colon leukocyten. (i) Frequentie van CD11c-Cre-geassocieerde GFP expressie onder de aangegeven colon myeloïde subsets. Rechthoek geeft Cre-positieve subsets die werden geselecteerd voor verdere analyse in j. (j) qPCR analyse van Il23a mRNA expressie door myeloïde subsets FACS-gesorteerd van CD11cIL-23 + en CD11cIL-23- muizen. Statistieken die cellen van CD11cIL-23+ en CD11cIL-23- muizen vergelijken worden getoond. (k) qPCR analyse van Il23a mRNA expressie door FACS-gesorteerde MHCII- en MHCII+ monocyten. De datapunten vertegenwoordigen individuele muizen, de balken geven de medianen aan. Alle staafdiagrammen van FACS-gesorteerde cellen geven het gemiddelde ± s.e.m. weer van 10-15 gepoolde muizen, gesorteerd in twee biologische replicaten. De gegevens zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, zoals bepaald door (a, j) one-way analysis of variance (ANOVA) met Bonferroni’s post-test of (b-h, k) Mann-Whitney U-test. DC, dendritische cel; MHCII, major histocompatibility complex class II.
PowerPoint slide
Om de myeloïde subsets die betrokken zijn bij IL-23-afhankelijke darmontsteking verder te karakteriseren, onderzochten we CD11c-Cre-geassocieerde GFP-expressie door lamina propria cellen van CD11cIL-23+ muizen. Analyse van CD45 + cellen bevestigde dat Cre-GFP expressie beperkt was tot leukocyten die CD11c uitdrukken op hun celoppervlak (Figuur 4f), maar werd voornamelijk waargenomen in CD11chi cellen. Bovendien werd Cre-geassocieerde GFP fluorescentie alleen waargenomen in MHCII + cellen (figuur 4g) en, interessant, Il23a mRNA expressie was beperkt tot Cre-GFP + cellen (figuur 4h). De meerderheid van de lamina propria MNP’s uiten hoge niveaus van CD11c (figuur 1e en aanvullende figuur S1b). Analyse van verschillende myeloïde subsets in CD11cIL-23 + muizen bleek dat CD11c-Cre-geassocieerde GFP expressie voornamelijk werd gedetecteerd onder macrofagen, CD103 + CD11b- DC’s, CD103 + CD11b + DC’s, (figuur 4i), en CD11b + DC’s (niet weergegeven). Bovendien was meer dan de helft van de MHCII + monocyten positief voor Cre-GFP, wat aangeeft dat al die subsets een potentiële bron van IL-23 zouden kunnen zijn. In tegenstelling, Cre expressie was afwezig van eosinofielen, neutrofielen, en MHCII- monocyten (Figuur 4i).
Om te karakteriseren welke van deze subsets een functionele bron van IL-23 in vivo vertegenwoordigen, beoordeelden we Il23a mRNA expressie door de overeenkomstige populaties gesorteerd door flowcytometrie van CD11cIL-23- en CD11cIL-23+ muizen 4 dagen na Hh infectie in de aanwezigheid van IL-10R blokkade. Opvallend was dat Il23a mRNA expressie in CD11cIL-23+ cellen meestal beperkt was tot MHCII+ monocyten en macrofagen, met lage expressie detecteerbaar onder CD103+ CD11b- DCs en CD103+ CD11b+ DCs (Figuur 4j). Bovendien was Il23a expressie door zowel MHCII + monocyten en macrofagen duidelijk verminderd in CD11cIL-23- muizen, wat aangeeft dat CD11c-Cre-expressie actief was binnen deze cellulaire subsets (figuur 4j). De lage Il23a expressie waargenomen in MHCII- monocyten (figuur 4k) suggereert dat inductie van IL-23 optreedt in de lamina propria tijdens hun lokale rijping en verwerving van MHCII.
Als het niveau van CX3CR1 expressie identificeert discrete subsets van MNP’s, herhaalden we onze analyse in CX3CR1GFP/+ muizen. In niet-geïnfecteerde muizen, werden lage niveaus van constitutieve Il23a gedetecteerd onder MHCII + monocyten, CD103 + CD11b + DCs, (Supplementary Figuur S4c,d), en CD11b + DCs (Supplementary Figuur S4d). Echter, verhoogde expressie van Il23a op 4 dagen na infectie met Hh en IL-10R blokkade werd alleen consequent gedetecteerd in MHCII + monocyten (Supplementair Figuur S4d) en macrofagen (niet weergegeven). Tijdens het verloop van de ontsteking, werd hoge Il23a expressie gehandhaafd in MHCII + monocyten en hun ontwikkeling progeny, maar niet CD103 + DCs (figuur 5a). Onder CX3CR1int subsets, expressie van Il23a was verder beperkt tot CD64 + cellen (figuur 5b).
Interleukine-23 (IL-23) productie tijdens colitis is beperkt tot CX3CR1-expressie van CD64 + subsets. CX3CR1GFP/+ muizen werden geïnfecteerd met Helicobacter hepaticus (Hh) gecombineerd met anti-IL-10R monoklonaal antilichaam (mAb) behandeling en geanalyseerd 2 weken na infectie naast niet-geïnfecteerde controles (Ctrl). Colon lamina propria cellen werden gesorteerd door flowcytometrie en Il23a mRNA expressie werd geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR). (a) Il23a mRNA-expressie en representatieve fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) plots van de volgende gesorteerde populaties: (1) MHCII+ monocyten (Mono), (2) Ly6Clo CX3CR1int macrofagen/DC’s, (3) CX3CR1hi macrofagen, en (4) CD103+ DC’s. (b) Il23a mRNA expressie en representatieve FACS plots van de volgende gesorteerde populaties: (1) CX3CR1int MHCII+ CD64- en (2) CX3CR1int MHCII+ CD64+ cellen. Staafdiagrammen vertegenwoordigen het gemiddelde + s.e.m. van 10-15 gepoolde muizen, gesorteerd in twee biologische replicaties. Gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. **P<0.01, ***P<0.001, zoals bepaald door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Bonferroni’s post-test. DC, dendritische cel; Macs, macrofagen; MHCII, major histocompatibility complex class II; Mono, monocyt; NS, niet significant.
PowerPoint slide
Alles bij elkaar genomen, wijzen onze gegevens erop dat de inductie van IL-23 in colitis besloten ligt in CX3CR1-expresserende CD11c+ cellen die ook MHCII en CD64 tot expressie brengen.
Batf3-afhankelijke CD103+ DC’s zijn onmisbaar voor chronische colitis
CD103+ CD11b+ DC’s worden voornamelijk gevonden in de dunne darm van de muis en zijn bijna afwezig in de dikke darm.6 In plaats daarvan zijn de meeste colon CD103+ DCs CD11b- en hebben ze de transcriptiefactor Batf3 nodig voor hun ontwikkeling.30 Batf3-/- muizen missen daarom weefsel-residente CD8α+ en CD103+ CD11b- niet-lymfoïde DC subsets. Zoals verwacht waren CD103+ CD11b- cellen sterk verminderd in de colon lamina propria van Batf3-/- muizen, terwijl CD103+ CD11b+ DCs onaangetast waren (Figuur 6a,b). Om na te gaan of CD103+ CD11b- DCs betrokken zouden kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis, hebben we Batf3-/- muizen geïnfecteerd met Hh in combinatie met anti-IL-10R behandeling. Op 2 weken na aanvang van colitis, aantallen CD103 + CD11b- DCs waren nog steeds aanzienlijk verminderd in de lamina propria (figuur 6b), maar geen verschillen in leukocyten infiltratie (figuur 6c) of de ernst van colitis (figuur 6d) werden waargenomen in Batf3-/- muizen in vergelijking met hun wild-type tegenhangers, wat aangeeft dat Batf3-afhankelijke DCs zijn overbodig voor de inductie van IL-23-gedreven darmontsteking in dit model.
Batf3-afhankelijke dendritische cellen (DCs) zijn onmisbaar voor de productie van interleukine-23 (IL-23) in door Helicobacter hepaticus (Hh)-gedreven colitis. Wild-type (WT) en Batf3-/- muizen werden geïnfecteerd met Hh in combinatie met anti-IL-10R monoklonaal antilichaam (mAb) behandeling en geanalyseerd na 2 weken naast niet-geïnfecteerde controles (Ctrl). (a) Vertegenwoordiger fluorescentie-geactiveerde cell sorting (FACS) plots en (b) frequenties en aantallen CD103 + CD11b- en CD103 + CD11b + cellen onder CD45 + colon leukocyten. (c) Totaal aantal lamina propria cellen per muis. (d) Histopathologie scores van de dikke darm. De datapunten vertegenwoordigen individuele muizen, de balken geven de medianen aan. *P<0.05 zoals bepaald door Mann-Whitney U-test, NS, niet significant.
PowerPoint slide
Mature macrofagen produceren IL-23 als reactie op H. hepaticus stimulatie in vitro, maar delen functionele redundantie met MHCII+ monocyten in vivo
Om de bijdrage van macrofagen aan de IL-23 productie te ontcijferen, genereerden we beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) van CD11cIL-23- en CD11cIL-23+ muizen. Na differentiatie met L929 cel-geconditioneerd medium, ongeveer de helft van de BMDMs waren positief voor Cre-GFP en uitgedrukt CD64, F4/80, en CD11c (Supplementary Figuur S5a). BMDMs werden in vitro gestimuleerd met levende Hh bacteriën in aanwezigheid van anti-IL-10R antilichaam en hun respons werd vergeleken met de respectievelijke controles. Opvallend was dat stimulatie van CD11cIL-23+ BMDMs met Hh resulteerde in Il23a mRNA expressie en dat deze respons werd versterkt in aanwezigheid van IL-10R signaal blokkade, terwijl Il23a niet tot expressie werd gebracht door niet gestimuleerde BMDMs of die behandeld waren met anti-IL-10R antilichaam alleen (Supplementary Figure S5b). Op dezelfde manier induceerde infectie van muizen met Hh alleen een lage uitbarsting van IL-23 in monocyten en macrofagen in vivo en deze respons werd sterk verhoogd in afwezigheid van IL-10R signalering (Supplementary Figure S5c).
Intestinale weefsel macrofagen komen uitsluitend voort uit bloedmonocyten en hebben geen zelfvernieuwing.8, 10 Colony-stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signalering regelt de differentiatie van Ly6Chi in Ly6Clo monocyten31 en is nodig voor de maturatie en vervanging van resident-type Ly6Clo monocyten en weefselmacrofagen, maar is niet nodig voor de productie van Ly6Chi monocyten of ontstekingsfunctie.32 Om de relatieve bijdragen van MHCII+ monocyten en weefselmacrofagen aan de ontwikkeling van IL-23-afhankelijke darmontsteking te beoordelen, hebben we CX3CR1GFP/+ muizen voorbehandeld met een anti-CSF-1R-blokkerend mAb of isotype controle vóór inductie van colitis. Een groep muizen werd geanalyseerd op dag 0 (Supplementary Figure S6a,b), terwijl de overige muizen werden behandeld met Hh en anti-IL-10R en bleef anti-CSF-1R behandeling te ontvangen. Op 4 dagen na Hh infectie en anti-IL-10R behandeling, waren macrofagen bijna afwezig in de dikke darm van anti-CSF-1R-behandelde muizen. De heterogene Ly6Clo CX3CR1int macrophage/DC compartiment was ook aanzienlijk verminderd in deze muizen (Figuur 7a,b en Supplementary Figure S6c). Hoewel het totale aantal colon leukocyten ongewijzigd was (figuur 7c), was er een toename van het aandeel van granulocyten in deze omstandigheden (figuur 7d). Interessant is dat de uitputting van macrofagen verder correleerde met verhoogde Il23a expressie binnen de lamina propria op dag 4 (figuur 7e). Echter, anti-CSF-1R-gemedieerde uitputting van macrofagen gedurende het gehele verloop van colitis had geen invloed op het aantal ontstekingscellen die zich ophopen in het colon (figuur 7f) of de ernst van de intestinale pathologie (figuur 7g) 2 weken na Hh infectie en IL-10R signalering blokkade, wat suggereert dat MHCII + monocyten en macrofagen kunnen functionele redundantie vertonen tijdens ontsteking.
Macrofagen delen functionele redundantie met MHCII + monocyten voor interleukine-23 (IL-23) productie. CX3CR1GFP / + muizen werden behandeld met een blokkerende anti-CSF-1R monoklonaal antilichaam (mAb) of isotype (Iso) controle en geanalyseerd (a-e) 4 dagen of (f, g) 2 weken na Helicobacter hepaticus (Hh) en anti-IL-10R mAb behandeling. (a) Representatieve fluorescentie-geactiveerde cell sorting (FACS) plots en (b) frequenties onder CD45 + leukocyten van de aangegeven myeloïde subsets, zoals gedefinieerd in figuur 1c. (c) Totaal aantal colon lamina propria cellen per muis. (d) Frequenties van neutrofielen onder CD45 + cellen. (e) Kwantitatieve PCR (qPCR) analyse van Il23a mRNA expressie door totale colon lamina propria cellen geanalyseerd op dag 4. (f) Totaal aantal colon lamina propria cellen per muis 2 weken na Hh en anti-IL-10R mAb behandeling. (g) Colon histopathologie scores. De datapunten vertegenwoordigen individuele muizen, de balken geven de medianen aan. Gegevens zijn samengevoegd van twee experimenten en representatief voor drie onafhankelijke experimenten. *P<0.05, **P<0.01, zoals bepaald door Mann-Whitney U-test. CSF, kolonie-stimulerende factor; DC, dendritische cel; Macs, macrofagen; MHCII, belangrijk histocompatibiliteitscomplex klasse II; NS, niet significant; Uninf, niet-geïnfecteerd.
PowerPoint slide