Cholinedeficiëntie vermindert de toename van het lichaamsgewicht en verbetert de glucosetolerantie bij ob/ob muizen

Abstract

Vorige studies toonden aan dat de toevoer van choline rechtstreeks verband houdt met een vetrijk dieet-geïnduceerde obesitas en insulineresistentie bij muizen. Het doel van deze studie was om na te gaan of cholinevoorziening ook obesitas en insulineresistentie veroorzaakt door een genetisch defect kan moduleren. Acht weken oude mannelijke ob/ob muizen werden gedurende twee maanden gevoed met ofwel een choline-arm dieet ofwel een choline-aangevuld dieet. Het weefselgewicht, inclusief vetmassa en vetvrije massa, werd bepaald. Intracellulaire signalering, plasma glucagon en insuline, en glucose en insuline tolerantie testen werden ook onderzocht. Het choline-deficiëntie dieet vertraagde de toename van het lichaamsgewicht en verminderde de vetmassa. Choline deficiëntie verlaagde ook de plasma glucosespiegel en verbeterde glucose en insuline tolerantie, hoewel de leververvetting verergerde. Een verhoogde vetlipolytische activiteit, een verlaagd plasma glucagon en een verminderde expressie van de leverglucagon receptor werden ook waargenomen bij het choline-deficiëntie dieet. Onze resultaten tonen aan dat een choline-arm dieet de vetmassa kan verminderen en de glucosetolerantie kan verbeteren bij zwaarlijvige en diabetische muizen veroorzaakt door een genetisch defect.

1. Inleiding

Choline is een belangrijke voedingsfactor, die betrokken is bij een aantal cruciale processen zoals de biosynthese van de neurotransmitter acetylcholine en de belangrijke membraancomponent fosfatidylcholine (PC) . PC kan worden gesynthetiseerd via de CDP-choline route of via methylering van fosfatidylethanolamine door fosfatidylethanolamine N-methyltransferase (PEMT). De PEMT-route is alleen kwantitatief significant in de lever. Choline is ook een essentiële precursor van de neurotransmitter acetylcholine, die werkt via muscarine- en nicotine-acetylcholinereceptoren. De laatste jaren is een mogelijk verband tussen choline en obesitas/diabetes aan het licht gekomen. Het potentieel van muscarine acetylcholine receptoren als therapeutisch doelwit voor obesitas is voorgesteld. Recent vonden we dat PEMT deficiëntie muizen kon beschermen tegen vetrijke voeding-geïnduceerde obesitas en insulineresistentie. Deze bescherming verdween echter wanneer een hoge dosis choline werd toegevoegd aan het vetrijke dieet. De PEMT pathway gevolgd door PC katabolisme is de enige bekende biosynthetische pathway voor choline bij zoogdieren. Een significante daling van het cholinegehalte in verschillende weefsels werd gevonden in PEMT-deficiënte muizen (Li et al., ongepubliceerde gegevens), wat een direct verband legt tussen choline en vetrijk dieet-geïnduceerde obesitas/insulineresistentie. In de huidige studie voerden we ob/ob muizen een choline deficiënt (CD) dieet om te evalueren of choline deficiëntie ook genetisch afgeleide obesitas en insulineresistentie kan moduleren.

2. Materiaal en Methoden

2.1. Alle procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care Committee van de Universiteit van Alberta in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. 8 weken oude mannelijke ob/ob muizen van The Jackson Laboratory werden gedurende 1 week geacclimatiseerd. In elke groep werden 5 muizen gebruikt. De muizen hadden vrije toegang tot choline deficiënte (CD) of choline-aangevulde (CS) diëten gedurende 2 maanden. Het CD dieet (MP Biomedicals Canada, catalogusnr. 901387) bevatte 20% vet in de vorm van reuzel. Het CS-dieet bestond uit het CD-dieet waaraan 0,4% (m/m) cholinechloride was toegevoegd. De muizen werden opgeofferd door verdoving met isofluraan, gevolgd door een hartpunctie.

2.2. Meting van lichaamsgewicht, vetvrije massa en vetmassa

Het lichaamsgewicht werd wekelijks gemeten. De vetvrije massa en de vetmassa werden geanalyseerd, 2 maanden nadat de muizen op dieet waren gezet (premortem), met behulp van het EchoMRI-systeem.

2.3. Glucose- en insulinetolerantietest

Glucosetolerantietest: na 12 uur vasten kregen de muizen een intraperitoneale injectie (i.p.) van 0,5 g dextrose/kg lichaamsgewicht, opgelost in gesteriliseerde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Insulinetolerantietest: na 6 uur vasten kregen de muizen een injectie van 1,0 eenheid insuline (Sigma)/kg lichaamsgewicht in PBS. Bloedglucoseconcentraties werden gemeten met een glucometer in staartbloedingen vóór en op de aangegeven tijdstippen na de injectie.

2.4. Metingen van Mitochondriaal Complex I/II Activiteit

De activiteiten van mitochondriaal complex I en II werden bepaald door gebruik te maken van mitochondriaal eiwit. Kort gezegd, om mitochondriaal eiwit te isoleren, werden monsters op ijs bewaard en gehomogeniseerd in een buffer die 75 mM sucrose, 225 mM sorbitol, 1 mM EGTA, en 0,1% vetzuurvrij runderserumalbumine in 10 mM Tris-HCl pH 7,4 bevatte. Het homogenaat werd gecentrifugeerd bij 600× g gedurende 15 min, en het resulterende supernatant werd verder gecentrifugeerd gedurende 20 min bij 16.200 rpm. Het mitochondriale eiwit in de pellets werd gesuspendeerd in een buffer die 20 mM Tris en 25 mM Sucrose (pH7,4) bevatte en bij -80°C bewaard tot gebruik. De meting van de activiteit werd uitgevoerd in een spectrofotometer gedurende een periode van 5min als een afname van de absorptie bij 600nm ten gevolge van de reductie van 2,6-dichloorfenol-indofenol (DCPIP) tot ubiquinon-1 in aanwezigheid van hetzij NADH (substraat van complex I) of succinaat (substraat van complex II) dienovereenkomstig. De reactie werd uitgevoerd in aanwezigheid van antimycine en kaliumcyanide als inhibitor van complex III en complex IV. Rotenon, als remmer van complex I, werd ook betrokken in de reactiebuffer voor complex II activiteit.

2.5. Histology and Immunoblotting

Voor de histologie werden de levers of vetkussentjes ontleed in 10% formaldehyde in PBS, gevolgd door de routine hematoxyline en eosine kleuring. Voor immunoblotting, na de homogenisering en centrifugatie bij 600 × g van de lever monsters, de resulterende supernatanten werden onderworpen aan eiwitconcentratie bepaling (BioRad) voor het waarborgen van gelijke hoeveelheid eiwitten werd geladen naar SDS-PAGE. Alle primaire antilichamen tegen hormoongevoelig lipase (fosfo-HSL/totaal HSL), fosfoenolpyruvaat carboxykinase, (PEPCK), Acetyl-CoA Carboxylase (fosfo-ACC/totaal ACC), en AMP-geactiveerd proteïne kinase (fosfo-AMPK/totaal AMPK) zijn aangekocht bij Cell Signaling. Antilichamen tegen pyruvaat dehydrogenase kinase isozyme 4 (PDK4), glucagon receptor werden verkregen van Abcam, maar suppressor van cytokine signalering 3 (SOCS3) en PGC-1α waren van Santa Cruz Biotechnology.Tublin of actine werd gebruikt als lading controles voor normalisatie. Afbeelding werd geanalyseerd door ImageJ software.

2.6. Plasma Insuline en Glucagon Measurement

De metingen werden uitgevoerd met behulp van een muis / rat glucagon, insuline assay kit (Meso Scale Discovery) op basis van de instructies van het bedrijf.

2.7. Statistische analyse

De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. De verschillen werden beoordeeld met de t-toets van de student. Een waarde van 𝑃<0,05 werd als significant beschouwd.

3. Resultaten

Choline-deficiënt dieet vertraagde de toename van het lichaamsgewicht aanzienlijk tot 2 maanden (figuur 1(a)) zonder de voedselconsumptie te beïnvloeden (dagelijkse voedselinname 7,21±1,23 g voor CD muizen versus 7,39±1,31 g voor CS muizen, 𝑃>0,05). Er was een significant verschil in startgewicht tussen de twee groepen (30,42±1,70 g voor CD muizen versus 26,3±2,26 g voor CS muizen, 𝑃=0,01). Choline deficiëntie had geen invloed op het gewicht van hart, lever of nieren (figuur 1 (b)), maar er was een significante afname van het gewicht van epididymale en perirenale vet (figuur 1 (c)). Verdere analyse, met behulp van magnetische resonantie beeldvorming, toonde aan dat choline deficiëntie het hele lichaam vetmassa daalde en toch verhoogd mager massa maakt niet uit uitgedrukt als absolute massa of relatief percentage van het hele lichaam massa (figuur 1 (d)). Choline deficiëntie verhoogde expressie van vetweefsel fosfohormoon-gevoelige lipase, een geactiveerde vorm van het enzym (figuur 1 (e)). Choline deficiëntie daarentegen veranderde de morfologie van het vetweefsel niet (figuur 1(f)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Naast de invloed op het lichaamsgewicht, verlaagde choline deficiëntie ook de nuchtere plasma glucose (14.3±1.67 versus 10.8±1.19, 𝑛=5, 𝑃<0.05) en glucagon niveau (figuur 2(a)), hoewel het geen effect had op plasma insuline niveau (figuur 2(b)). Een aanzienlijk verbeterde glucose en insuline intolerantie werden waargenomen bij muizen op choline-deficiënt dieet (figuren 2(c)-2(d)). Om het onderliggende mechanisme te onderzoeken, werden de belangrijkste enzymen voor glucose oxidatie geanalyseerd. Choline deficiëntie verminderde hepatische eiwitexpressie van PDK4 (figuur 3 (a)), een negatieve regulator van pyruvaat dehydrogenase activiteit die de instroom van mitochondriale acetyl-CoA regelt, wat wijst op een verhoogd glucose gebruik. Evenzo werden hepatische PGC-1α (een bekende upstream-modulator van PDK4) en PEPCK (een downstream target van PGC-1 α en een sleutelenzym voor gluconeogenese) verminderd (Figuur 3(b)), wat wijst op een verminderde gluconeogenese. Bovendien onderzochten we of de verbeterde glucose- en insuline-intolerantie in verband kon worden gebracht met de verandering van leverontsteking en mitochondriale functie. Noch de eiwitexpressie van SOCS3 (figuur 3(c)), een marker van pro-inflammatie, noch de activiteit van mitochondriaal citraat synthase werd beïnvloed (gegevens niet weergegeven). Echter, de activiteit van mitochondriaal complex II, maar niet complex I, werd aanzienlijk verminderd door choline deficiëntie (figuur 3 (d)). Van belang is dat de eiwitexpressie van de lever glucagon receptor ook werd verminderd door choline deficiëntie (figuur 3 (e)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figuur 2

Choline-deficiënt dieet verbetert glucose en insuline intolerantie. 8 weken oude mannelijke ob/ob muizen hadden gedurende 2 maanden vrije toegang tot CD- of CS-diëten. Het niveau van nuchter plasma glucagon (a) en insuline (b) werd gemeten. Intraperitoneale glucosetolerantietest (c) en insulinetolerantietest (d) werden uitgevoerd. ∗𝑃<0,01 en ∗𝑃<0,05 in vergelijking met de CS-groep.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figuur 3

Moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de verbeterde insulinegevoeligheid bij ob/ob muizen op een choline-deficiënt dieet. 8 weken oude mannelijke ob/ob-muizen hadden gedurende 2 maanden vrije toegang tot CD- of CS-diëten. De eiwitexpressie in de lever van PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c), en glucagon receptor (e) werd bepaald door immunoblotting. De activiteiten van mitochondriaal complex I en II werden ook gemeten (d). ∗De resultaten van deze metingen zijn vergelijkbaar met die van de CS groep (

Hoewel de glucosetolerantie verbetert, verergert choline deficiëntie de leververvetting, ondersteund door histologische analyse en verhoogde lever triglyceride massa (figuur 4(a)). Om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan choline deficiëntie-geïnduceerde vette lever, hebben we gekeken naar de enzymen die betrokken zijn bij vetzuur β-oxidatie en lipogenese. Choline deficiëntie verhoogde lever glycerol-3-fosfo-acyltransferase (GPAT) activiteit (figuur 4 (b)) en verminderde de activiteit van β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (β-HAD) (figuur 4 (c)), een belangrijk enzym van vetzuur β-oxidatie, wat aangeeft dat meer intracellulaire vetzuren werden gekanaliseerd in lipide biosynthese in plaats van oxidatie. Dit idee werd verder ondersteund door een afname van de hepatische fosfo-AMPK en fosfo-ACC expressie (figuur 4(d)), die vervolgens ACC activeert en de hepatische lipogenese versterkt.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figuur 4

Moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van leververvetting bij ob/ob muizen op een choline-deficiënt dieet. 8 weken oude mannelijke ob/ob-muizen hadden gedurende 2 maanden vrije toegang tot CD- of CS-dieet. De leversecties werden gekleurd met het H & E-kleuringsprotocol, en de hoeveelheid levertriglyceride werd gemeten (a). De activiteiten van glycerol-3-fosfaat-acyltransferase (GPAT) (b) en β-hydroxyl acyl-CoA dehydrogenase (β-HAD) (c) werden getest. De eiwitexpressie van fosfo-AMPK en fosfo-ACC werd gecontroleerd (d). ∗𝑃<0.05 in vergelijking met de CS-groep.

4. Discussie

In eerder werk hebben we aangetoond dat choline-suppletie verband houdt met vetrijk dieet-geïnduceerde obesitas en insulineresistentie bij PEMT-deficiënte muizen. Onlangs hebben we ontdekt dat choline-geïnduceerde insulineresistentie choline-specifiek is, niet alleen in wild-type muizen maar ook in PEMT-deficiënte muizen (Wu en Vance et al. ongepubliceerde gegevens). In de huidige studie onderzochten we de impact van choline deprivatie op ob/ob muizen. Wij toonden vijf nieuwe effecten van choline deficiëntie aan: (1) verhoogde vet lipolytische activiteit; (2) verbeterde glucose oxidatie; (3) verminderde hepatische vetzuuroxidatie; (4) gedownreguleerde hepatische glucagon receptor expressie; (5) verminderde hepatische mitochondriale complex II activiteit.

4.1. Choline deficiëntie vermindert lichaamsgewichtstoename

Choline deficiëntie vermindert significant vet-dieet-geïnduceerde obesitas in Pemt-/- muizen en gewichtstoename in ob/ob muizen. Raubenheimer et al. meldden echter dat choline deficiëntie geen effect had op gewichtstoename of het gewicht van vetweefsel. Het verschil tussen de twee studies zou te wijten kunnen zijn aan verschillen in de diermodellen en de voedingsprotocollen. In de studie van Raubenheimer kregen C57Bl/6 muizen gedurende 8 weken een vetrijk of een vetarm dieet, maar de muizen kregen alleen de laatste 4 weken het CD- of CS-dieet. Onze ob/ob muizen kregen gedurende 8 weken het vetrijke CD of CS dieet. In de literatuur zijn zowel mannelijke als vrouwelijke ob/ob muizen uitgebreid gebruikt in metabole studies, zoals gewichtstoename en lever- (en spier-) insulinegevoeligheid, en er is geen significant sekse-effect gerapporteerd. In onze studie werden alleen mannelijke ob/ob muizen gebruikt.

Onze huidige studie toont aan dat choline ook genetisch-afgeleide obesitas kan moduleren. Aangezien choline deficiëntie geen invloed had op de voedselconsumptie, kan verhoogde vet lipolytische activiteit (verhoogde expressie van actief hormoongevoelig lipase) een verklaring zijn voor verminderde vetmassa en gewichtstoename. Daarnaast kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat choline deficiëntie de energie-uitgaven of de expressie van UCP1 in bruin vetweefsel en UCP2/UCP3 in skeletspieren kan verhogen, wat mogelijke factoren zijn die bijdragen aan verminderde gewichtstoename. Choline Deficiëntie Verbetert Glucose Tolerantie

In tegenstelling tot choline suppletie, die in verband wordt gebracht met een hoog-vet-dieet-geïnduceerde insulineresistentie bij muizen , verbeterde choline deficiëntie de glucosetolerantie bij ob/ob muizen. Dit is consistent met de studie van Raubenheimer, waar C57Bl/6 muizen op een CD hoog-vet-dieet verlaagde insuline niveaus en verbeterde glucose tolerantie hadden in vergelijking met choline aangevuld hoog-vet dieet . Hoge plasma glucagon wordt meestal gevonden in type 2 diabetische patiënten . Choline injectie verhoogde zowel plasma insuline en glucagon niveaus bij ratten . Omgekeerd, verminderde choline-deficiëntie in onze studie het plasma glucagon en verminderde expressie van de glucagon receptor. Aangezien in de afgelopen jaren glucagon receptor antagonisten zijn voorgesteld als de potentiële therapeutische geneesmiddelen voor type 2 diabetes , dus verminderde expressie van eiwitten van glucagon receptor in ob/ob muizen op choline deficiëntie dieet, tot op zekere hoogte, kan de verbeterde glucose tolerantie verklaren. De verminderde PGC-1α expressie in de lever ging gepaard met een downregulatie van PEPCK en PDK4, wat duidt op een verminderde glucoseproductie en een verhoogde glucoseoxidatie. Down-regulatie van β-HADH activiteit suggereerde een verminderde vetzuuroxidatie. Deze processen gingen gepaard met een verminderde mitochondriale complex II activiteit, wat een compensatoire reactie op verminderde mitochondriale oxidatieve stress kan weerspiegelen. De door CD verbeterde glucosetolerantie was dus het gevolg van een verminderde leverglucoseproductie en een verhoogd glucosegebruik. Dit zou kunnen gebeuren door onderdrukking van de leverglucagon receptor, die AMPK reguleert via adenylaat cyclase, waardoor PGC-1α en zijn downstream targets, zoals PEPCK en PDK4, gemoduleerd worden, evenals de lever mitochondriale elektronentransport capaciteit. Er is dus verder onderzoek nodig om te bewijzen of de glucagonreceptor een nieuw therapeutisch doelwit voor diabetes zou kunnen zijn.

4.3. Het verband tussen leververvetting en insulineresistentie

Vetzuchtige lever is een onafhankelijk van obesitas voorspellende factor gebleken voor type 2 diabetes. Verhoogde intracellulaire vetzuren worden verondersteld een oorzakelijke rol te spelen in leverinsulineresistentie. In de huidige studie verergerde choline deficiëntie de leververvetting, waarbij een daling in β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase activiteit en een stijging in glycerol palmitoyl-acyl transferase activiteit werden waargenomen, wat een rol van choline in de modulatie van het vetzuurmetabolisme suggereert. Daarom kan het omleiden van vetzuren naar de lever triglyceride opslag een initieel beschermend mechanisme zijn om de lever intracellulaire vetzuurconcentraties te verlagen. Langdurige choline deficiëntie is echter verbonden met hepatosteatose, risico op neurale buisdefecten, evenals het risico op kanker en geheugenverlies , wat het gebruik van een choline-deficiënt dieet als een langdurige therapeutische strategie voor obesitas en insulineresistentie kan beperken.

Concluderend, choline deficiëntie kan gewichtstoename voorkomen en de glucosetolerantie verbeteren bij ob/ob muizen. Bescheiden beperking van choline-bevattende voedselinname kan gunstig zijn voor obesitas, prediabetes en diabetische patiënten. Onze resultaten suggereren nieuwe mogelijke therapeutische benaderingen.

Afkortingen

PC:	Phosphatidylcholine
PEMT:	Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase
CD:	Choline deficiënt
CS:	Choline supplement
HSL:	Hormoon gevoelig lipase
PEPCK:	Phosphoenolpyruvate carboxykinase
ACC:	Acetyl-CoA Carboxylase
AMPK:	AMP-activated protein kinase (AMPK)
PDK4:	Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4
SOCS3:	Suppressor of cytokine signaling 3
GPAT:	Glycerol-3-phospho-acyltransferase.

Bijdrage van de auteurs

G. Wu en L. Zhang hebben een gelijke bijdrage geleverd.

Author Disclosure

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie (MOP 89793) van de Canadese Institutes of Health Research.