Laine begon pas halverwege haar twintiger jaren professioneel te zingen. Haar eerste invloeden als zangeres waren Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland en Lena Horne. Op 24-jarige leeftijd deed zij met succes auditie voor John Dankworths kleine groep, de Dankworth Seven, en later voor zijn orkest, waarmee zij tot 1958 optrad. Dankworth en Laine trouwden dat jaar in het geheim in het Hampstead Register Office. De enige getuigen waren een vriend van het paar, pianist Ken Moule, en Dankworth’s arrangeur, David Lindup. Het echtpaar kreeg twee kinderen, die beiden succesvolle musici in hun eigen vak zijn: Alec die in de VS woont, en Jacqui, een Britse zangeres die een aantal albums heeft uitgebracht.
Ze speelde de hoofdrol in een nieuw toneelstuk in het Londense Royal Court Theatre, de thuisbasis van de nieuwe golf van toneelschrijvers uit de jaren vijftig, zoals John Osborne en Harold Pinter. Dit leidde tot andere podiumoptredens, zoals de musical Valmouth in 1959, het toneelstuk A Time to Laugh (met Robert Morley en Ruth Gordon) in 1962, Boots With Strawberry Jam (met John Neville) in 1968, en uiteindelijk tot haar rol als Julie La Verne in Wendy Toye’s productie van Show Boat in het Adelphi Theatre in Londen in 1971. Show Boat had zijn langste run tot nu toe in dat Londense seizoen met 910 opgevoerde voorstellingen.
Tijdens deze periode had ze twee grote opname successen. “You’ll Answer to Me” bereikte de Britse Top 10 terwijl Laine “prima donna” was in de 1961 Edinburgh Festival productie van Kurt Weill’s opera/ballet The Seven Deadly Sins, geregisseerd en gechoreografeerd door Kenneth MacMillan. In 1964 werd haar album Shakespeare and All that Jazz met Dankworth goed ontvangen. Dankworth en Laine richtten in 1970 het Stables theater op in wat het oude stallenblok was op het terrein van hun huis. Het was een onmiddellijk succes, met 47 concerten in het eerste jaar.
Laine’s internationale activiteiten begonnen in 1972, met een succesvolle eerste tournee door Australië, waar ze zes top-100 albums uitbracht gedurende de jaren 1970. Kort daarna werd haar carrière in de Verenigde Staten gelanceerd met een concert in New York’s Lincoln Center, in 1973 gevolgd door de eerste van vele Carnegie Hall optredens. Al snel volgden kust-tot-kust tournees door de VS en Canada, en daarmee een opeenvolging van platenalbums en televisie-optredens, waaronder The Muppet Show in 1977. Dit leidde, na verschillende nominaties, tot haar eerste Grammy award, als erkenning voor de live opname van haar Carnegie concert in 1983. Ze is periodiek blijven toeren, onder meer in Australië in 2005.
Ze heeft samengewerkt met James Galway, Nigel Kennedy, Julian Lloyd Webber en John Williams. Andere belangrijke opnames in die tijd waren duetalbums met Ray Charles (Porgy and Bess) en Arnold Schönbergs Pierrot Lunaire, waarvoor ze een Grammy Award nominatie ontving.
Laine’s relatie met het musicaltheater begon in Groot-Brittannië en werd in de Verenigde Staten voortgezet met hoofdrollen in Sondheims A Little Night Music en Franz Lehár’s The Merry Widow (Michigan Opera). In 1980 speelde ze de hoofdrol in Colette, een musical van Dankworth. De show begon in het Stables theater, Wavendon, in 1979 en verhuisde naar het Comedy Theatre, Londen, in september 1980. In 1985 vertolkte ze de rol van Prinses Puffer in de Broadway musical The Mystery of Edwin Drood, waarvoor ze een Tony nominatie kreeg. In 1989 werd ze door de critici van Los Angeles geprezen voor haar vertolking van de Heks in Sondheim’s Into the Woods.
In mei 1992 trad Laine op met Frank Sinatra voor een concertweek in de Royal Albert Hall in Londen.
Tegen het einde van de jaren 1990 waren Laine’s concerten over de hele wereld uitverkocht, meestal ondersteund door Dankworth met zijn band, orkest of kleinere groep. Haar gebruikelijke band bestond uit John Horler (piano), Alec Dankworth (bas), Allan Ganley (drums) en Mark Nightingale (trombone).
Laine’s autobiografie, Cleo, werd gepubliceerd in september 1994 door Simon & Schuster. Haar tweede boek, You Can Sing If You Want To, werd gepubliceerd door Victor Gollancz in oktober 1997. In 2000 verscheen ze als zangeres Gwen in de film The Last of the Blonde Bombshells.
In de New Year’s Honours lijst van 1997 werd Laine een Dame Commander, en ze werd benoemd tot Dame Cleo Laine DBE. In de nieuwjaarslijst van 2006 werd haar man tot ridder vrijgezel geslagen en werd hij Sir John Dankworth. Zij waren een van de weinige echtparen waarbij beide partners hun titel op persoonlijke titel hadden en het enige echtpaar in de jazz dat op deze manier werd erkend.
Dankworth overleed op 6 februari 2010, enkele uren voor een gepland concert in het Stables theater in Wavendon om het 40-jarig bestaan van de zaal te vieren. Hij was al enkele maanden ziek na een concerttournee in de Verenigde Staten. Ondanks haar verdriet trad Laine op tijdens het 40-jarig jubileumconcert, samen met de John Dankworth Big Band en verschillende leden van haar familie – ze kondigde zijn dood pas aan het einde aan. Laine’s besluit om op te treden haalde de voorpagina’s van kranten over de hele wereld, waaronder een volledige foto van haar op de voorpagina van The Times.
Een week na Dankworth’s dood trad Laine in de plaats van haar overleden echtgenoot en verscheen opnieuw in concert in Pinner in noordwest Londen. Laine bleef optreden en interviews geven in de maanden na Dankworths dood. In juni en juli 2010 trad ze op als hoofdact op het Music in the Garden festival in Wavendon.
In maart 2010 werd Laine’s laatste muzikale samenwerking met Dankworth uitgebracht op cd en als download – Jazz Matters. Op de opname speelde de Dankworth Big Band nieuwe composities die Dankworth had geschreven voor het optreden van het duo tijdens de Proms 2007 in de Royal Albert Hall.
Laine staat niet alleen bekend om haar interpretatieve stijl, maar ook om haar bereik van bijna vier octaven en haar vocale aanpassingsvermogen. Naast het raken van diepe soulvolle noten, zijn Laine’s scatting en top noten haar handtekening geworden. Hoewel haar natuurlijke bereik dat van een alt is, kan ze een G produceren boven de hoge C. Derek Jewel van de Sunday Times noemde haar “simpelweg de beste zangeres ter wereld.”