Een chimaera was een wezen in de Griekse mythologie dat gewoonlijk werd voorgesteld als een samenstelling van een leeuw, een geit en een slang. Het hedendaagse gebruik van de term “chimerisme” in hematopoietische celtransplantatie is afgeleid van dit idee van een “gemengde” entiteit, verwijzend naar iemand die een transplantatie van genetisch verschillend weefsel heeft ontvangen. Een test op chimerisme na een hematopoëtische stamceltransplantatie omvat het identificeren van de genetische profielen van de ontvanger en van de donor en vervolgens het evalueren van de mate van vermenging in het bloed, beenmerg of ander weefsel van de ontvanger.
Chimerismetests (engraftmentanalyse) door DNA maken gebruik van een methodologie die algemeen wordt gebruikt bij het testen van de menselijke identiteit en wordt bereikt door de analyse van genomische polymorfismen die short tandem repeat (STR) loci worden genoemd. Deze loci bestaan uit een DNA-kernsequentie die een variabel aantal keren wordt herhaald binnen een afzonderlijke genetische locus. De term STR, ook wel microsatellieten genoemd, heeft betrekking op het aantal basenparen van een tandem-herhaalde DNA-kernsequentie, die varieert in lengte van 2 tot 8 basenparen. Deze loci vertonen allelen die tussen individuen in lengte kunnen verschillen en die als codominante Mendeliaanse eigenschappen worden overgeërfd. STR loci zijn geïdentificeerd in het menselijk genoom en sommige loci hebben meer dan 25 allelen.
DNA sequentie informatie binnen de geconserveerde flankerende regio’s van de loci wordt gebruikt om oligonucleotide primer paren voor de STRs te creëren. Deze primers worden gebruikt bij PCR (polymerase kettingreactie) amplificatie van testmonsters. Deze techniek kan de STR-sequentie wel een miljard keer amplificeren, waardoor materiaal wordt verkregen dat met een elektroforetische gel of door capillaire elektroforese (CE) kan worden gescheiden. Genotypering gebeurt door evaluatie van de grootte van de DNA-fragmenten. Referentie naar een allel-ladder kan worden gebruikt voor exacte identificatie van STR-allelen.
Het op PCR gebaseerde STR/CE-systeem heeft verschillende voordelen boven andere analysemethoden. De amplificatie van meerdere STR loci kan worden gecombineerd (multiplexing) in één enkel buisje, waardoor analyse van maximaal zestien loci in één reactie mogelijk wordt. Aangezien er minieme hoeveelheden DNA nodig zijn, kunnen monsters met lage celaantallen worden gebruikt, en de geringe grootte van de STR-allelen maakt het zelfs mogelijk om gedegradeerde DNA-monsters te gebruiken. De digitale gegevens vergemakkelijken de analyse en archivering, en het CE-proces is zowel snel als kosteneffectief. PCR amplificatie en analyse van STR loci biedt een snelle en betrouwbare methode voor de evaluatie van de graftatiestatus bij stamceltransplantatie.
De momenteel gebruikte technologie maakt de co-amplificatie en driekleurendetectie mogelijk van zestien loci die zijn onderverdeeld in 3 sets van 5 of 6 loci die geamplificeerde fragmenten vertonen met niet-overlappende groottebereiken.
Tijdens de PCR-amplificatiefase worden de geamplificeerde fragmenten gelabeld met fluorescerende kleurstoffen. Na de PCR-amplificatie worden de monsters verwerkt op een capillair elektroforesesysteem (CE).
De gegevensanalyse wordt vergemakkelijkt door een fragmentanalysesoftware die de DNA-fragmenten met behulp van een interne rijstrookstandaard die met het monster is uitgevoerd, meet en genotypen toekent door vergelijking met een STR-alleladder die in de CE-reeks is opgenomen. Dit levert verschillende STR-genotypische profielen op voor de donor en voor de ontvanger van het transplantaat. STR-loci die polymorf (d.w.z. informatief) zijn tussen deze individuen, worden gebruikt om de relatieve hoeveelheden ontvangend en donor-DNA in het posttransplantatiemonster te bepalen.
De geteste monsters kunnen afkomstig zijn van elk DNA-houdend materiaal, waaronder beenmerg, perifeer bloed, vaste tumoren, epidermaal weefsel, haarfollikels, buccale swabs en gefractioneerde celondersets. Aangezien PCR-amplificatie van een monster routinematig wordt uitgevoerd met minder dan 2 ng genomisch DNA (overeenkomend met ongeveer 300 cellen), kunnen chimerismetests met deze methode met succes worden uitgevoerd, zelfs voor patiënten met transplantaatfalen, ernstige leukopenie, of van hematopoiëtische celsubgroepen. STR-analyse is gebruikt om de entstatus te evalueren van patiënten die een hematopoiëtische celtransplantatie hebben ontvangen, waaronder patiënten die dubbele navelstrengbloeddonoreenheden of een tweede transplantatie van een andere donor hebben ontvangen; ook is de genetische identiteit van vermoedelijke eeneiige tweelingen bevestigd en is enting van moedercellen in de baarmoeder gedetecteerd bij patiënten met een diagnose van ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (Severe Combined Immunodeficiency – SCID). STR/CE-analyse is een snelle, betrouwbare, nauwkeurige en reproduceerbare procedure.
Beperkingen van het Assay
- Voldoende DNA moet uit de testmonsters worden geïsoleerd om een robuuste PCR-amplificatie mogelijk te maken. Er moeten DNA-isolatiemethoden beschikbaar zijn om monsters met een laag aantal cellen te kunnen verwerken, zoals kan voorkomen bij ontvangers met transplantaatfalen en uit doorstroomcytometrie lijnspecifieke gesorteerde witte bloedcelsubsets. De monsters kunnen te lage concentraties hebben om met UV-spectrofotometrie OD260 te kwantificeren. DNA-monsters van 5.000 tot 30.000 geïsoleerde cellen leveren op betrouwbare wijze een aanvaardbare amplificatie op. Het laboratorium heeft richtlijnen die bepalen wanneer de monsteranalyse moet worden herhaald.
- Met de commerciële kits hebben veel STR-loci informatieve allelen voor zowel donor als ontvanger in de onverwante-donorsetting. Het aantal informatieve STR-loci kan echter beperkt zijn tot slechts 3 bij verwante donortransplantatieparen. Kwantitatieve waarden die het gemiddelde van slechts 3 STR-loci weergeven, zijn reproduceerbaar gebleken.
- Patiënten met kwaadaardige ziekten kunnen klonale mutaties hebben die van invloed zijn op bepaalde STR-loci. Een allel van een patiënt kan afwezig zijn op een of meer STR-loci wanneer de allelen die zijn geïdentificeerd in het patiëntmonster van vóór de transplantatie worden vergeleken met het monster van na de transplantatie. In zeldzame omstandigheden kan een extra STR-allel van de patiënt worden gedetecteerd op een specifieke locus die niet aanwezig was in het pre-transplantatiemonster. In de meeste gevallen zijn deze anomalieën waarschijnlijk te wijten aan chromosoomtranslocaties. Ontbrekende allelen kunnen ook het gevolg zijn van een mutatie binnen de STR geconserveerde flankerende sequenties waar de PCR-primers zich bevinden. De gegevens van STR-loci met ontbrekende of extra allelen worden niet voor kwantificering gebruikt.
- Als de cellen van vóór de transplantatie niet beschikbaar zijn, kunnen na de transplantatie monsters zoals buccaswabs, huidbiopsie of haarwortels worden verzameld. Er zij echter op gewezen dat buccale monsters aanzienlijke hoeveelheden donorcellen kunnen bevatten.
- De test is niet bedoeld voor de detectie van minimale restziekten.
Clinische indicaties voor chimeertests bij hematopoëtische celtransplantatie
Routinematige documentatie na de transplantatie van de donor/ontvanger-afkomst van witte bloedcellen in perifeer bloed en/of beenmerg. Documentatie van enting kan het testen van lijnspecifieke celondergroepen omvatten, zoals CD3-positieve T-cellen en CD33-positieve myeloïde cellen.
Evaluatie van donor-/ontvangende cellen bij patiënten met een ontoereikende beenmergfunctie.
Stel vast of recidiverende of nieuwe maligniteit afkomstig is van ontvanger- of donorcellen.
Bepaal de prognostische risico’s van afstoting en recidiverende maligniteit.
Documenteer de persistentie van donorcellen na transplantatie bij patiënten met recidiverende ziekte of voorafgaand aan donorlymfocyteninfusie (DLI).
Evalueer of transplantaatafstoting is opgetreden bij ontvangers die kandidaat zijn voor een tweede transplantatie.
Differentieer de herkomst van donorcellen bij ontvangers die een tweede transplantatie met een andere donor of een transplantatie met dubbele navelstrengbloedeenheden hebben ontvangen.
De aanwezigheid van cellen afkomstig van het moederdier opsporen bij patiënten bij wie ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID) is vastgesteld.
De genetische identiteit van vermoedelijke eeneiige tweelingen verifiëren.
Veel gestelde vragen
Vraag: Hoe worden meervoudige donoren geanalyseerd?
Antwoord: Het is essentieel om STR loci te identificeren die ten minste één uniek STR allel voor de patiënt en elke donor laten zien.
Vraag: Waarom wordt er getest op maternale enting?
Antwoord: Patiënten met de diagnose Severe Combined ImmunoDeficiency (SCID) kunnen in de baarmoeder geënterd zijn met hematopoietische cellen van maternale oorsprong. Bepaalde subsets van lijnspecifieke cellen (vooral CD3-positieve cellen) kunnen overwegend of geheel van maternale oorsprong zijn.
Vraag: Wat is het verschil tussen “volledig” en “gemengd” chimerisme?
Antwoord: “Volledig” chimerisme wordt gebruikt om te verwijzen naar een patiënt die na transplantatie een fenotype in hematopoietische cellen vertoont dat geheel van donoroorsprong is.
“Gemengd” chimerisme verwijst naar een patiënt die na transplantatie een mengsel van patiënt- en donorfenotype in hematopoietische cellen vertoont.
Vraag: Wat als een basismonster van de ontvanger niet beschikbaar is?
Antwoord: Er zijn verschillende opties beschikbaar voor het verkrijgen van een ontvangermonster na transplantatie: buccale veeg-, haarwortel-, of huidbiopsiemonsters kunnen worden gebruikt voor een ontvangermonster voor de uitgangssituatie. Buccale veegmonsters moeten met voorzichtigheid worden gebruikt omdat donorcellen in aanzienlijke hoeveelheden aanwezig kunnen zijn in buccale monsters.
Vraag: Wat als er geen basismonster van de donor beschikbaar is?
Antwoord: Als de donor nog leeft, neem dan een nieuw bloedmonster. Als de donor niet in leven is, moeten de monsters van na de transplantatie worden vergeleken met de basismonsters van vóór de transplantatie om STR-allelen te identificeren die worden gedetecteerd maar niet van de patiënt afkomstig zijn.
Vraag: Waarom is HLA geen haalbaar middel om engraftment te controleren?
Antwoord: Transplantatie donoren worden gekozen om zo goed mogelijk overeen te komen met de ontvanger. Er zijn geen HLA-markers die de ontvanger en de donor van elkaar onderscheiden als zij gematcht zijn, en slechts een of twee als zij niet gematcht zijn. Bovendien zijn andere technologieën voor dit doel vaak gevoeliger dan het monitoren van HLA mismatched allelen; bijgevolg worden andere loci gebruikt om unieke profielen te verschaffen.
Vraag: Wat is een informatieve STR locus?
Antwoord: Dit is een locus met ten minste één allel dat uniek is voor de ontvanger of de donor. Om bruikbaar te zijn voor chimerismeberekeningen, moet een locus allelen hebben die voor beide uniek zijn. Er kan een groot aantal informatieve loci zijn wanneer een onverwante donor voor de transplantatie wordt gebruikt, maar zeer weinig wanneer een gematchte broer of zus wordt gebruikt. Vanwege de verschillen in amplificatie-efficiëntie van de allelen op elke locus verdient het de voorkeur om gemiddelde of mediane waarden van verscheidene loci te verkrijgen om de nauwkeurigheid te vergroten. Resultaten van afzonderlijke loci zijn betrouwbaar reproduceerbaar, zodat zelfs één locus kan worden gebruikt voor het trending van opeenvolgende monsters.
Vraag: Wat is de “amelogenin” locus die in sommige amplificatiepanels is opgenomen?
Antwoord: Het amelogenine gen bevindt zich op de X en Y chromosomen. Het is geen STR, maar vertoont verschillende groottes van producten op de respectieve chromosomen. Dit maakt het nuttig voor het bepalen van het geslacht. Het wordt opgenomen in het primerpaneel van commerciële kit-verkopers die zich richten op de forensische gemeenschap waar X/Y-differentiatie veel wordt gebruikt. Het wordt over het algemeen niet gebruikt voor chimerisme-analyse, omdat het geen unieke vrouwelijke marker kan opleveren (een mannelijk monster bevat altijd een X-allel); ook is het niet nuttig bij de evaluatie van monsters na een stamceltransplantatie op basis van geslacht.
Vraag: Waarin verschilt STR chimerisme analyse van genotypering?
Antwoord: “Genotype” verwijst naar de specifieke allelen die aanwezig zijn in een specifieke locus. Genotypering wordt gedaan om ontvanger- en donorprofielen vast te stellen bij chimerismetests. Wanneer chimerisme analyse wordt gedaan na een stamceltransplantatie, worden de genotypische profielen van de ontvanger en van de donor vergeleken met het post-transplantatie monster profiel om te evalueren hoeveel van elke component aanwezig is.
Genotypering wordt ook gebruikt in andere scenario’s zoals forensisch onderzoek en afstammingsonderzoek. Forensische analisten gebruiken genotypes om de bron van bewijsmateriaal in strafzaken te identificeren en om mensen als verdachten uit te sluiten. Zij kunnen ook menselijke resten identificeren in “John Doe”-zaken en bij massale rampen. Ouderschapsbepalingen worden op een soortgelijke manier uitgevoerd om iemand als mogelijke ouder uit te sluiten door bij het kind allelen te vinden die noch met de moeder, noch met de vermoedelijke vader overeenkomen.
Geciteerde literatuur/aanbevolen lectuur
Bryant E, Martin PJ. Documentation of engraftment and characterization of chimerism following hematopoietic cell transplantation. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoietische celtransplantatie. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.