De mogelijkheid om een correlatie aan te tonen tussen een paar biomoleculen werd sterk verbeterd door Erik Manders van de Universiteit van Amsterdam, die de correlatiecoëfficiënt van Pearson onder microscopisten introduceerde, samen met andere coëfficiënten waarvan de “overlappingscoëfficiënten” M1 en M2 de populairste en nuttigste zijn gebleken. Het doel van het gebruik van coëfficiënten is de mate van overlapping tussen beelden te karakteriseren, meestal twee kanalen in een multidimensionaal microscopiebeeld dat bij verschillende emissiegolflengten is opgenomen. Een populaire aanpak werd geïntroduceerd door Sylvain Costes, die de correlatiecoëfficiënt van Pearson gebruikte als een instrument om de drempels die M1 en M2 nodig hebben op een objectieve manier vast te stellen. Costes benadering maakt de veronderstelling dat alleen positieve correlaties van belang zijn, en levert geen bruikbare meting van PCC.
Hoewel het gebruik van coëfficiënten de betrouwbaarheid van colocalisatiedetectie aanzienlijk kan verbeteren, hangt dit af van een aantal factoren, waaronder de omstandigheden van hoe monsters met fluorescentie werden geprepareerd en hoe beelden met colocalisatie werden verkregen en verwerkt. Studies moeten met grote omzichtigheid worden uitgevoerd, en na zorgvuldige achtergrondlezing. Momenteel wordt het gebied geteisterd door verwarring en een gestandaardiseerde aanpak is nog niet stevig gevestigd. Pogingen om dit recht te zetten omvatten heronderzoek en herziening van sommige coëfficiënten, toepassing van een factor om te corrigeren voor ruis, “Replicate based noise corrected correlations for accurate measurements of colocalization”. en het voorstel van verdere protocollen, die grondig werden herzien door Bolte en Cordelieres (2006). Door de neiging van fluorescentiebeelden om een zekere hoeveelheid onscherp signaal en poisson shot en andere ruis te bevatten, moeten zij bovendien meestal worden voorbewerkt alvorens te worden gekwantificeerd. Zorgvuldige beeldrestauratie door deconvolutie verwijdert ruis en verhoogt het contrast in de beelden, waardoor de kwaliteit van de colokalisatie-analyseresultaten wordt verbeterd. Tot nu toe berekenen de meest gebruikte methoden om colokalisatie te kwantificeren de statistische correlatie van pixelintensiteiten in twee verschillende microscopiekanalen. Recentere studies hebben aangetoond dat dit kan leiden tot hoge correlatiecoëfficiënten, zelfs voor targets waarvan bekend is dat ze zich in verschillende cellulaire compartimenten bevinden. Een robuustere kwantificering van colokalisatie kan worden bereikt door een combinatie van digitale objectherkenning, de berekening van de gebiedsoverlapping en de combinatie met een pixel-intensiteit correlatiewaarde. Dit heeft geleid tot het concept van een object-gecorrigeerde Pearson’s correlatiecoëfficiënt.