Gap Junction Membrane Channel Proteins and Connexins
Connexins zijn een familie van ten minste 15 eiwitten die intercellulaire membraankanalen van gap junctions vormen en diffusionele verplaatsing van ionen, metabolieten en potentiële signaleringsmoleculen mogelijk maken. Deze structurele moleculen spelen een belangrijke rol in de tweerichtingscommunicatie tussen de oöcyt en de granulosacellen. Van verschillende connexines is aangetoond dat zij een belangrijke rol spelen tijdens de folliculogenese. Connexine 37 proteïne komt tot expressie in primaire en groeiende follikels. Connexine 37 (Gja4) knock-outs bevatten op de leeftijd van 2 weken veel zich ontwikkelende preantrale follikels, maar grote Graafian follikels worden niet waargenomen (233). Daarom blijkt histologisch dat gebrek aan Cx37 de ontwikkeling van preantrale tot antrale follikels blokkeert. Elektronenmicroscopie studies toonden aan dat terwijl de Cx37 knock-outs adherens junctions bevatten, ze gap junctions aanwezig in wild type eierstokken misten. Ondanks het ontbreken van Graafian follikels, vertoonden de nulde eierstokken kleinere structuren die leken op corpora lutea die 5-10 keer talrijker waren. De voortijdige luteïnisatie waargenomen in null dieren suggereert dat junctionele communicatie kan een belangrijk mechanisme reguleren corpus luteum vorming zijn. De connexine 37 knock-out had een kleinere gemiddelde oöcyt grootte. Terwijl 52.8% van de oöcyten van Cx37+/- muizen de meiose hervatte, waarbij 26.8% van hen overging tot de metafase van meiose I en 26% tot de metafase van meiose II, hervatte slechts 2.2% van de Cx37-/- oöcyten de meiose in kweek, waarbij de overgrote meerderheid (86.3%) zich in het germinale vesicale stadium bevond. Al deze waarnemingen tonen duidelijk aan dat connexine 37 essentieel is op het moment van de pre-antrale naar de antrale follikelovergang, en waarschijnlijk betrokken is bij het transport van metabolieten die nodig zijn voor deze overgang.
Connexine 43 (Gja1) proteïne is de meest voorkomende connexine in de eierstok, en komt al tot expressie vanaf E14.5. Connexine 43 gap junctions interconnect granulosa cellen die de oöcyt omringen, alsmede oöcyten en granulosa cellen. Connexine 43 (Gja1) knock-outs sterven bij de geboorte als gevolg van cardiovasculair falen (234). Eierstokken in null muizen, die bij de geboorte worden opgehaald, zijn ongewoon klein, blijkbaar door een tekort aan kiemcellen (235). Het tekort aan kiemcellen werd getraceerd tot op dag 11,5 van de dracht, wat impliceert dat het ontstaat tijdens de vroege stadia van de ontwikkeling van de kiemlijn. Om postnatale folliculogenese in Gja1-/- muizen te bestuderen, werden foetale en neonatale eierstokken geënt in het rechter nierkapsel van een geovariectomiseerde en immuungecompromitteerde prkdcscid/Prkdcscid muis (236). De transplantaten werden na 1-3 weken verwijderd en de histologie van de eierstokken werd onderzocht. Na 3 weken ontwikkeling in de niertransplantaten kon in de wild-type eierstokken een reeks follikelstadia van primordiaal via primair, secundair en tertiair worden gezien. Daarentegen kwamen de Gja1-nul eierstokken niet verder dan primaire follikels. Onderzoek van transplantaten na 1, 2 en 3 weken toonde aan dat mutant granulosa cellen niet in staat waren te prolifereren. De groei van de eicellen was ook trager bij de mutanten in vergelijking met de wildtype dieren. Oöcyten van Gja1 mutanten konden niet bevrucht worden. Elektronenmicroscopie toonde ook aan dat deze oöcyten abnormaal zijn in vergelijking met het wildtype.
Connexin 43 blijkt gereguleerd te worden door de gonadotropines, FSH en LH. Omdat Cx43 overvloediger aanwezig is in grote antrale follikels in vergelijking met kleine antrale en preantrale follikels, hebben sommigen de hypothese gesteld dat FSH de synthese van Cx43 induceert. In tegenstelling, de preovulatoire golf van LH wordt gevolgd door een daling van het niveau van mRNA coderend voor Cx43 (237,238). Verdere bevestiging kwam van experimenten met behulp van exogene toediening van gonadotrofinen. Injectie van FSH in hypophysectomized ratten bevorderd een toename van de ovariële gap junctional membraan, terwijl hCG, die ovulatie induceert, leidde tot een significante vermindering van de hoeveelheid gap junctions in granulosa cellen (239,240). In vitro toediening van FSH en LH aan granulosa cellijnen bevestigde de in vivo waarnemingen (241,242). Er is gesuggereerd dat de effecten van de gonadotropines op Cx43 gemedieerd worden door steroïde hormonen (243). Andere signaalwegen kunnen Cx43 ook reguleren, waaronder de BMP/Smad en de MAPK-Ras paden waarvan onlangs is aangetoond dat ze de Cx43 promotor in vitro reguleren (244,245).
Deze resultaten impliceren dat gap junctional koppeling gemedieerd door Cx43 kanalen een onmisbare rol speelt in zowel kiembaanontwikkeling als postnatale folliculogenese. De zeer verschillende fenotypes van de eierstokken als gevolg van de Cx37 en Cx43 knock-outs geven aan dat de gap-junctionele koppeling tussen de eicel en zijn cumulus granulosa cellen een andere rol vervult dan die tussen de granulosa cellen onderling, waarbij mogelijk verschillende moleculen betrokken zijn. Connexine 32, ook tot expressie gebracht in de eierstok, blijkt bij knock-out geen invloed te hebben op de vruchtbaarheid (246), wat suggereert dat dit redundante gap junctions componenten zijn die nog moeten worden geïdentificeerd.
Extra cellulaire verbindingen kunnen belangrijk zijn voor antrum vorming en granulosa cel-oocyt interacties. Een deel van de intercellulaire communicatie tussen granulosa cellen en oöcyten wordt verondersteld te worden gemedieerd door transzonale projecties (TZPs) tussen de oöcyt en granulosa cellen (41). Met name microtubule-TZP’s (MT-TZP) lijken bij deze communicatie betrokken te zijn (41). De MT-TZP verbindingen tussen de oöcyt en granulosa cellen is verondersteld te zijn onder de controle van FSH (247). FSH priming van wild type en Fsh-/- resulteert in veranderingen in de MT-TZP zodanig dat de TZPs teruggetrokken worden uit de oöcyt (247). Dit resulteert in veranderingen in de ontwikkeling van de eicel zoals gemeten door chromatine remodellering en verwerving van meiotische competentie (247). Uit deze experimenten kan de hypothese worden afgeleid dat zonder FSH priming, granulosa cellen een stabiele interactie hebben met de oöcyt, waardoor de paracriene uitwisseling van factoren mogelijk wordt. Zodra de MT-TZPs zijn teruggetrokken, wordt de ontwikkeling van de eicel versneld. Of oöcyt-specifieke factoren zoals GDF9 en BMP15 of andere onbekende oöcyt-factoren ook de vorming en/of relatie van TZPs moduleren, moet nog worden onderzocht.