US en Canadese vistors, vraag een GRATIS SAMPLE aan van onze CTAB gebaseerde SYNERGY™ 2.0 Plant DNA Extractie Kit HERE.
DNA isoleren uit plantenweefsels kan zeer uitdagend zijn omdat de biochemie tussen uiteenlopende plantensoorten extreem kan zijn. In tegenstelling tot dierlijke weefsels waar hetzelfde weefseltype van verschillende soorten gewoonlijk vergelijkbare kenmerken heeft, kunnen planten variabele niveaus van metabolieten en structurele biomoleculen hebben. Polysacchariden en polyfenolen zijn twee klassen van plantaardige biomoleculen die sterk variëren tussen soorten en zeer problematisch zijn bij het isoleren van DNA. Vervuilende polysachariden en polyfenolen kunnen interfereren met manipulaties van DNA na isolatie.
Methodes zijn beschikbaar die effectief polysachariden en polyfenolen uit plant DNA-preparaten verwijderen. Het gebruik van CTAB (cetyltrimethylammoniumbromide), een kationisch detergens, vergemakkelijkt de scheiding van polysacchariden tijdens de zuivering, terwijl additieven, zoals polyvinylpyrrolidon, kunnen helpen bij het verwijderen van polyfenolen. Extractiebuffers op basis van CTAB worden veel gebruikt bij het zuiveren van DNA uit plantenweefsels.
Een optie voor het zuiveren van DNA met CTAB maakt gebruik van het feit dat polysacchariden en DNA verschillende oplosbaarheden hebben in CTAB, afhankelijk van de concentratie natriumchloride. Bij hogere zoutconcentraties zijn polysacchariden onoplosbaar, terwijl bij lagere concentraties DNA onoplosbaar is. Door de zoutconcentratie aan te passen in lysaten die CTAB bevatten, kunnen polysacchariden en DNA dus verschillend worden geprecipiteerd.
Polyfenolen zijn verbindingen die meer dan één fenolische ring bevatten (bv. tannine), een structuur die zich zeer efficiënt aan DNA bindt. Zij komen van nature in planten voor, maar worden ook gegenereerd wanneer planten weefselbeschadiging hebben (bruinverkleuring). Bij het homogeniseren van plantenweefsels worden polyfenolen gesynthetiseerd door vrijgekomen polyfenoloxidase. De toevoeging van polyvinylpyrrolidon voorkomt de interactie van DNA en fenolische ringen door de polyfenolen te binden.
Protocollen op basis vanCTAB werken meestal zeer goed, maar een belangrijk nadeel is dat chloroformextracties routinematig worden gebruikt om de organisch oplosbare moleculen te scheiden van het DNA. Aangezien chloroform kankerverwekkend is, wordt het gebruik ervan door veel instellingen afgekeurd. Daarom heeft OPS Diagnostics een alternatieve methode ontwikkeld waarbij geen gebruik wordt gemaakt van chloroform; deze methode is te vinden op de pagina Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Materialen
- CTAB buffer: 2% cetyltrimethylammoniumbromide, 1% polyvinylpyrrolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, of CTAB-extractiebuffer
- Centrifuge (tot 14.000 x g)
- RNase A-oplossing
- Isopropanol
- 70% ethanol
- 2 ml centrifugeerbuisjes
- SpeedVac
- TE Buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Methode
Plantenmonsters kunnen worden bereid door weefsel na koeling in vloeibare stikstof cryogeen te malen in een vijzel en stamper. Gevriesdroogde planten kunnen bij kamertemperatuur worden vermalen. In beide gevallen is een fijn poeder het beste voor het extraheren van DNA.
- Voor elke 100 mg gehomogeniseerd weefsel gebruik 500 µl van CTAB extractiebuffer. Meng en vortex grondig. Breng het homogenaat over naar een 60°C bad gedurende 30 minuten.
- Na de incubatieperiode centrifugeert u het homogenaat gedurende 5 minuten bij 14.000 xg.
- Supernatans overbrengen in een nieuwe buis. Voeg 5 µl RNase-oplossing A toe en incubeer bij 37°C gedurende 20 minuten
- Voeg een gelijk volume chloroform/isoamylalcohol (24:1) toe. Vortex gedurende 5 seconden en centrifugeer het monster gedurende 1 minuut bij 14.000 xg om de fasen te scheiden. Breng de waterige bovenste fase over in een nieuw buisje. Herhaal deze extractie totdat de bovenste fase helder is.
- Breng de bovenste waterige fase over in een nieuw buisje. Neerslag het DNA door toevoeging van 0,7 volume koude isopropanol en incubeer bij -20 ° C gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer het monster bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. Giet het supernatant af zonder de pellet te verstoren en was vervolgens met 500 µl ijskoude 70% ethanol. Decanteer de ethanol. Verwijder resterende ethanol door drogen in een SpeedVac.
- Droog de pellet lang genoeg om de alcohol te verwijderen, maar zonder het DNA volledig te drogen. Los het DNA op in 20 µl TE-buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Het kan nodig zijn het pellet te verwarmen om het op te lossen.
Optioneel protocol:
Het gebruik van silica-spinkolommen kan een hogere kwaliteit DNA opleveren. Voor een optioneel protocol, klik hier.