DNA-methyltransferases (MTases) die een methylgroep van S-adenosylmethionine overbrengen op adenine- of cytosineresiduen, worden in een grote verscheidenheid van prokaryoten en eukaryoten aangetroffen. Methylering moet worden overwogen wanneer DNA met restrictie-endonucleasen wordt gedigesteerd, omdat splitsing kan worden geblokkeerd of verhinderd wanneer een bepaalde base in de herkenningsplaats is gemethyleerd.
Prokaryotische methylering
In prokaryoten zijn MTasen meestal geïdentificeerd als elementen van restrictie-/modificatiesystemen die het gastheer-DNA beschermen tegen splitsing door het overeenkomstige restrictie-endonuclease. De meeste laboratoriumstammen van E. coli bevatten drie plaatsspecifieke DNA-methylases.
- Dam-methylase-methylering op de N6-positie van het adenine in de sequentie GATC (1,2).
- Dcm-methyltransferases-methylering op de C5-positie van het tweede cytosine in de sequenties CCAGG en CCTGG (1,3).
- EcoKI-methylase-methylering van adenine in de sequenties AAC(N6)GTGC en GCAC(N6)GTT.
Enkele of alle locaties voor een restrictie-endonuclease kunnen resistent zijn tegen splitsing wanneer zij geïsoleerd zijn uit stammen die de Dam- of Dcm-methylases tot expressie brengen, indien de methylase-herkenningsplaats de endonuclease-herkenningsplaats overlapt. Zo is plasmide-DNA geïsoleerd uit dam+ E. coli volledig resistent tegen splitsing door MboI, dat op GATC-locaties splijt.
Niet alle DNA geïsoleerd uit E. coli is in dezelfde mate gemethyleerd. Terwijl pBR322 DNA volledig gemodificeerd is (en daarom volledig resistent tegen MboI digestie), zijn slechts ongeveer 50% van de λ DNA Dam sites gemethyleerd, vermoedelijk omdat het methylase niet de kans krijgt om het DNA volledig te methyleren voordat het in de faagkop wordt verpakt. Als gevolg hiervan zullen enzymen die door Dam- of Dcm-modificatie worden geblokkeerd, gedeeltelijke verteringspatronen met λ DNA opleveren.
Restrictieplaatsen die door Dam- of Dcm-methylering worden geblokkeerd, kunnen worden gedemethyleerd door uw DNA in een dam-, dcm- stam van E. coli te kloneren, zoals dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Restrictieplaatsen kunnen ook worden geblokkeerd als er een overlappende plaats aanwezig is. In dat geval wordt een deel van de Dam- of Dcm-sequentie gegenereerd door de sequentie van het restrictie-enzym, gevolgd door de flankerende sequentie. Met deze situatie moet ook rekening worden gehouden bij het ontwerpen van restrictie-enzym digests.
Eukaryotische methylering
CpG MTases, gevonden in hogere eukaryoten (b.v. Dnmt1), brengen een methylgroep over naar de C5 positie van cytosine residuen. Patronen van CpG-methylering zijn erfelijk, weefselspecifiek en correleren met genexpressie. Bijgevolg wordt verondersteld dat CpG-methylering een rol speelt bij differentiatie en genexpressie (4).
Notitie: De effecten van CpG-methylering zijn vooral een probleem bij het ontleden van eukaryotisch genomisch DNA. CpG-methyleringspatronen blijven niet behouden wanneer het DNA eenmaal in een bacteriële gastheer is gekloneerd.
Methyleringsgevoeligheid
De onderstaande tabel geeft een overzicht van de methyleringsgevoeligheid voor NEB-restrictie-enzymen, waarbij wordt aangegeven of splitsing al dan niet wordt geblokkeerd of belemmerd door Dam-, Dcm- of CpG-methylering indien of wanneer deze elke herkenningsplaats overlapt. Deze tabel moet worden gezien als een leidraad voor het gedrag van de vermelde enzymen en niet als een absolute indicator. Raadpleeg REBASE , de database van restrictie-enzymen, voor meer gedetailleerde informatie en specifieke voorbeelden waarop deze richtlijnen zijn gebaseerd.
- Marinus, M.G. and Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. and Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legend
| ● | Niet Gevoelig | ◆ | Gehandicapten |
| ◼ | Geblokkeerd | ◇ ol | Geblokkeerd door overlapping |
| ◻ ol | Geblokkeerd door overlapping | ◇ scol | Geblokkeerd door sommige combinaties van overlappingen |
| ◻ scol | Geblokkeerd door sommige combinaties van overlappingen | ||
Code met één letter