RESULTATEN
Identificatie van kandidaat dierlijke pool domein (APD) regulerende genen
Om de vroege regulerende toestand van de APD in de zee-egel embryo te definiëren, hebben we gelijktijdig gebruik gemaakt van zowel bio-informatica en experimentele benaderingen tot genen coderen regulerende eiwitten die tot expressie komen in thisterritorium voor gastrulatie te identificeren. De bio-informatica benadering maakte gebruik van de genoom sequentie annotatie inspanningen van ons laboratorium (Burke et al., 2006) en van anderen (Howard-Ashby et al.,2006a; Howard-Ashby et al.,2006b; Materna et al.,2006; Tu et al.,2006), die APD expressiepatronen gedocumenteerd van vele genen die transcriptiefactoren coderen en/of die orthologs waren van factoren waarvan bekend is dat ze functioneren in neuraal weefsel in embryo’s van andere soorten. De experimentele aanpak vergeleek de vertegenwoordiging van RNA’s in Δcadherin mRNA-geïnjecteerdeversus normale embryo’s in het uitkomen blastula stadium. Embryo’s zonder nucleairβ-catenine bestaan bijna uitsluitend uit dierlijke pool ectoderm, zoals blijkt uit de expressiepatronen van foxq2 en hbn. In normale embryo’s, zijn deze mRNA’s beperkt tot de dierlijke pool beginnend bij blastula stadia (Burke et al., 2006;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) en thedomains van hun expressie in mesenchyme blastula stadium overlappen bij de dierlijke pool (Fig. 1B-D). Naarmate de ontwikkeling vordert door gastrulatie, vormt het domein vanhbn-expresserende cellen een ring die cellen omringt diefoxq2 tot expressie brengen (Fig. 1F). Wanneercanonieke Wnt, Nodal en BMP signalering worden alle geëlimineerd door ΔcadherinmRNA injectie, het dier de helft van het embryo drukt foxq2 terwijl de meeste van de rest van het embryo uitdrukt hbn (Fig. 1H). Deze patronen geven aan dat embryo’s die canonieke Wnt en Nodal-BMP2/4 signalering missen, bijna volledig bestaan uit een dramatisch uitgebreide APD, waarvan de buitenste grenzen worden gedefinieerd door hbn expressie. Foxq2 en hbntranscripts verschijnen in de APD tijdens de late kloof/vroege blastula stadia, wat aangeeft dat specificatie van de APD ten minste tegen die tijd plaatsvindt.
Δcadherin-misexpressie embryo’s bestaan uit dierlijke pool domein (APD) weefsels gedefinieerd door expressie van foxq2 en hbn.Whole-mount in situ hybridisaties op embryo’s in mesenchyme blastula (A-D) en gastrulae (E-H) stadia. (E,F) Glycerol-geïnjecteerde controle. (G,H) Δcadherin-mRNA geïnjecteerd. (A,E,G) DIC; (B-D,F,H) Tweekleuren-fluorescentie, hbn (groen) en foxq2 (magenta) RNAs. Schaalbalk: 20 pm
Om vroege APD regulerende genen te identificeren, vergeleken we de relatieveconcentraties van individuele mRNA’s in Δcadherin mRNA- versusglycerol-geïnjecteerde embryo’s in het uitkomen blastula stadium met behulp van een microarray die alle genvoorspellingen gevonden in de zee-egel genoomsequentie (Wei et al., 2006). Dit stadium markeert de overgang tussen splitsing en het begin van morfogenese en ligt kort na het tijdstip waarop de vroegste markers voor de APD zijn ontdekt (Burke et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008). Er werd een reeks genen geïdentificeerd die coderen voor transcriptiefactoren en componenten van signaalwegen met een gemiddeld ten minste 3-voudig hogere expressie in twee reeksen metΔcadherin mRNA geïnjecteerde embryo’s. Deze overlapten gedeeltelijk met de reeks kandidaat-genen die door de bioinformatica waren geïdentificeerd. De gecombineerde sets bevatten 27 genen en vormen een voorlopigeearly APD regulerende genen set (E-APD) (tabel 1).
- View inline
- View popup
Gevoeligheid van genen in de E-APD set om verlies van nucleaireβ-catenine
Om de vroegst tot expressie komende genen binnen de E-APD set te identificeren, onderzochten we microarray-gegenereerde temporele expressie profielen zoals eerder beschreven (Wei et al., Patronen werden geverifieerd door vergelijking met gepubliceerde gegevens (Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) en door onze whole-mount in situ hybridisaties (onze ongepubliceerde waarnemingen). De genen werden gesorteerd in drie groepen: die welke maximaal vertegenwoordigd waren in de RNA-populatie van de vader (Fig.2A), die welke sterk geüpreguleerd waren tijdens de splitsingsstadia (Fig. 2B,C) en die welke geüpreguleerd waren tussen de late splitsingsstadia en de vroege gastrula stadia (Fig. 2D). Wij concentreerden ons eerst op de leden van de vroeg embryonale expressiegroep. Zoals hieronder getoond, met behulp van zowel verlies- en winst-of-functie assays, identificeerden we er een, Sp-Six3 (hierna Six3), die werkt op of nabij de top van de APD generegulatory hiërarchie.
Six3 komt vroeg tot expressie in de APD
De identificatie van zee-egel Six3 is ondubbelzinnig omdat zijn sequentie zeer sterk geconserveerd is in het homeodomein (98% identiek aanHsSix3), het zesdomein (91%) en het groucho-interactiedomein (71%) (zieFig. S1 in het aanvullend materiaal). Wij bevestigden eerdere studies waaruit blijkt dat Six3 tot expressie komt in een dynamisch patroon tijdens de ontwikkeling vanParacentrotus lividus (Poustka etal., 2007), een soort die nauw verwant is aan Strongylocentrotuspurpuratus die in deze studie werd gebruikt. De belangrijkste kenmerken zijn datSix3 transcripten tot expressie komen in de dierlijke hemisfeer tijdens de latecleavage (Fig. 3A), in de APD tegen het uitgekomen blastulastadium (Fig.3B) en vervolgens in twee ringen (Fig.3G,H), één nabij de periferie van de APD (Fig. 3C-F,H) en de andere in het endomesoderm (Fig. 3C-G), tijdens de mesenchym blastulastadia. Tijdens de gastrulatie wordt Six3 tot expressie gebracht in enkele secundaire mesenchymcellen verspreid over de blastocoel en aan het uiteinde van het archenteron (Fig. 3I, pijl), zoals gerapporteerd door Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), in cellen in de dierpool (Fig. 3I,J) en in het orale ectoderm (Fig. 3J,K). In het pluteus stadium wordt Six3 RNA gedetecteerd in twee clusters van cellen die de mond flankeren (Fig. 3K, pijlen) en in de gescilieerde band (Fig. 3K).
Six mRNA algemene niveaus in het vroege mesenchyme blastula stadium veranderen niet significant na injectie van Δcadherine mRNA (Tabel 1). In situhybridisaties zijn consistent met dit resultaat en tonen aan dat de distributiondiffers in Δcadherin mRNA-geïnjecteerde embryo’s, die afwezig zijn van vegetale cellen en het behoud van de brede dierlijk halfrond expressie die is establishedbefore beperking door processen afhankelijk van canonieke Wnt (zie Fig. S2 in het bijgevoegde materiaal).
Six3 functie is vereist voor APD vorming en differentiatie van neuronen
Om de functie van Six3 te testen, injecteerden we in bevruchte eieren twee verschillende Six3-translatie-blokkerende morfolino’s, die elk dezelfde ontwikkelingsdefecten uitlokten. Embryo’s na 3 dagen namen een afgeronde morfologie aan (Fig. 4A,B) en spicules waren ofwel verminderd of afwezig. Het ectoderm van de dierlijke pool miste de verdikte epitheliale morfologie die kenmerkend is voor de dierlijke plaat (Fig. 4, vergelijk A,B met C,haakjes). Bij sommige partijen embryo’s verliep de gastrulatie normaal, zij het vertraagd, en uit de positie van het archenteron bleek dat de orale/aborale polariteit tot stand was gebracht (Fig.4A). In andere partijen exogastruleerden de meeste embryo’s. Bij embryo’s zonder Six3 werd de neurale differentiatie sterk geremd, zoals aangetoond door immunokleuring voor neurale merkers die normaal tot expressie komen tijdens de lategastrula en pluteus stadia (Fig.4, vergelijk A,B met C). De meerderheid (2/3) van de embryo’s bevatte noserotonerge neuronen en de rest had een verminderd aantal (Fig. 4D) in vergelijking met het normale aantal in dit stadium (3-5). Hetzelfde gold voor alle andere neuronen, gemeten met de pan-neurale merker synaptotagmin (1e11) (Fig. 4A,B), die gevonden worden in de APD en de ciliated band van normale 3-daagse embryo’s (Fig. 4C). Opmerkelijk was dat de expressie van hbn gereduceerd was tot een niveau dat niet gedetecteerd kon worden door in situhybridisatie (Fig. 4F versus Fig. 4E). QPCR metingen bevestigden deze waarneming en toonden aan dat de niveaus van zowel hbn alsfoxq2 mRNAs, die respectievelijk de buitenste grenzen en de binnenste delen van de APD markeren, 8- tot 10-voudig verlaagd waren bij Six3 morfanten in het themachyme blastula stadium (Fig.5).
Temporele expressie profielen van genen in de voorlopige vroege APDset. Profilering methoden waren zoals beschreven door Wei et al.(Wei et al., 2006). Waarden op verschillende uren na de bevruchting van 2 tot 72 worden getoond, als een percentage van de maximale signaalintensiteit, voor elk gen op 2-cel (maternaal RNA), 15-uur vroeg blastula (EB), 30-uur laat mesenchyme blastula (LMB), 48-uur lategastrula (LG) en 72-uur pluteus larve (PL). De profielen zijn gegroepeerd volgens het tijdstip van de vroegst waarneembare expressie: (A) maternale; (B,C) vroege blastula; (D) vroege blastula tot mesenchymeblastula. De positie van de stippellijn vertegenwoordigt het tijdstip van de bepaling in Six3morfanten. Gegevens voor het gen Six3 zijn gemarkeerd met een rode pijl.
Six3 is vereist voor expressie van de meeste genen in de E-APDset
Het opvallende fenotype geproduceerd door verlies van Six3, evenals de vroege expressie ervan in het embryo, suggereerde dat het zou kunnen functioneren in de buurt van de top van hetAPD gen-regulerend netwerk. Om deze mogelijkheid verder te onderzoeken, gebruikten we microarray analyse om te zoeken naar Six3-afhankelijke genen op 27 uur, het tijdstip waarop genen in de E-APD set maximale expressieniveaus benaderen. Om de endomesodermale functies van Six3 te elimineren, voerden we deze screening uit in embryo’s die geïnjecteerd waren metΔcadherine. Zoals blijkt uit Fig. 5A, elimineerde het verlies van Six3 in deze embryo’s volledig de ontwikkeling van alle overtollige neuronen die gevonden werden in met Δcadherine geïnjecteerde embryo’s en er vormde zich geen verdikt epitheel, wat nogmaals een belangrijke rol voor Six3 in de ontwikkeling van APD aantoont. De microarray-gegevens identificeerden een verrassend groot aantal genvoorspellingen (682) die sterk werden gedownreguleerd (ten minste 4-voudig) in embryo’s die dubbel werden geïnjecteerd metΔcadherin mRNA en Six3-MO, vergeleken met embryo’s die alleen metΔcadherin mRNA werden geïnjecteerd. Bovendien werd meer dan 60% van alle genen in het vorige microarray-onderzoek die ten minste 3-voudig werden geüpreguleerd in metΔcadherin mRNA geïnjecteerde embryo’s, en die daarom waarschijnlijk tot expressie komen in de APD, significant gedownreguleerd door verlies van Six3. Belangrijk is dat microarray gegevens aangaven dat de meerderheid van de E-APD genen gevoelig waren voor Six3 (Fig. 5B, geel). QPCR metingen in twee andere partijen embryo’s toonden aan dat slechts 5 E-APD genen niet significant afhankelijk waren van Six3 (Fig. 5B, rood, blauw).
Six3 overexpressie is voldoende om de APD uit te breiden
Deze resultaten ondersteunen sterk het idee dat Six3 vroeg in de APD-gen regulerende netwerken functioneert, en wekken de mogelijkheid dat het misschien voldoende is om andere cellen in het embryo te induceren om APD fates aan te nemen.Misexpressie van Six3 resulteerde in embryo’s die een buitengewone verandering in morfologie vertoonden. Een hoefijzervormige band van dicht opeengepakte cellen breidde zich uit in de vegetale richting van de dierlijke pool (Fig. 6, vergelijk B,C met A). Serotonerge neuronen, normaal beperkt tot de dierlijke plaat (Fig. 6D), verviervoudigde in aantal en werden verdeeld langsheen de dichte band (Fig. 6G). Bovendien zijn de zuilvormen en de rangschikking van neurale projecties insynaptotagmin-bevattende cellen (1e11) vergelijkbaar met die in de dierlijke plaat van controle embryo’s (Fig. 6E, wit gestippeld kader versus Fig.6H). Al deze cellen bevatten in hun kernen NK2.1 (Fig. 6J-M, groen), een transcriptiefactor die normaal tot expressie komt in de dierplaat en het aangrenzende boven-orale ectoderm (Fig. 6I,I′; groene cirkels inFig. 6U), evenals een paar cellen in de voordarm (Takacs et al.,2004). Een keten van 1e11-positieve neurale cellen doorsnijdt de band (Fig. 6K, rood) en cellen aan de binnenzijde van de NK2.1-positieve band brengen ook Gsc tot expressie (Fig. 6L,N, rood). De combinatie van NK2.1 en Gsc markeert op unieke wijze het supra-orale aangezichtsepitheel aan de orale rand van de dierplaat (Fig.6I,I′, gele cellen enFig. 6U, gele cirkels). De dicht opeengepakte zuilvormige cellen van de uitgebreide band omringen meer afgeplatte epitheelcellen die NK2.1 tot expressie brengen, maar niet Gsc (Fig. 6M,N), net zoals cellen van de bovenste regionen van de mond van normale embryo’s (Fig. 6I, mond, m). Verder bewijs dat deze cellen vergelijkbaar zijn met die bij de mond van normale embryo’s is dat zij hbn mRNA tot expressie brengen, dat zich bij normale 3-daagse embryo’s ophoopt rond de rand van de dierplaat en zich uitbreidt in het supra-orale ectoderm (Fig.1, Fig. 6O). In Six3-expressieve embryo’s zijn de hbn-positieve cellen geconcentreerd in het dunne epitheel aan de vegetale pool en bevinden zich dus op dezelfde plaats ten opzichte van de uitgebreide dierlijke plaat en de Nk2.1-positieve cellen in de bovenste voordarm als in normale embryo’s (Fig.6P,Q). De zijde tegenover het mondgebied differentieert zich als een dunschillig epitheel, drukt de aborale ectoderm merker, Spec1 (Fig. 6R-T) en kan overeenkomen met de hbn-positieve strook van aborale ectoderm grenzend aan de dierlijke plaat. Samen leiden deze genexpressiepatronen tot de opmerkelijke conclusie dat Six3 voldoende is om de lotgevallen van cellen in het grootste deel van de rest van het embryo opnieuw te specificeren, en zo een 3-daags embryo te genereren dat bestaat uit een sterk uitgebreid, maar correct gevormd, dierlijk pooldomein met orale/aborale polariteit. De APD in normale en Six3-misexpressing embryo’s wordt aangeduid door de blauwe cirkels in Fig. 6U.
Whole-mount in situ hybridisatie voor six3 mRNA tijdens de ontwikkeling. Tijden in uren na de bevruchting zijn aangegeven in de rechterbovenhoek van elk beeld. (A) Zeer vroege blastula. (B) Uitkomende blastula. (C-H) Mesenchyme blastula. (I,J) Lategastrula. (K) Pluteus. Alle embryo’s zijn afgebeeld in zijaanzicht, behalve in G en H, die respectievelijk de vegetale pool (vv) en de dierlijke pool (apv) laten zien. Pijlen in I en K markeren de posities van secundaire mesenchymcellen en cellen die de mond flankeren, respectievelijk. Schaalstreep: 20 μm.
Verlies van Six3 resulteert in verlies van neuronen en de verdikte epitheel kenmerkend voor de APD. (A,B) Drie-daagse embryo’s geïnjecteerd met Six3-MO2 in het een-cellig stadium, die typerend zijn voor respectievelijk het sterkere en zwakkere fenotype. (C) Normale 3-daagse embryo. APD in A-C aangegeven tussen haakjes; 1e11 (pan-neuraal, magenta), serotonine (groen), DAPI (kernen, blauw). (D) Aantallen embryo’s met hetzij 0, 1, 2 of 3 serotonerge neuronen per embryo in Six3 morfanten. In dit stadium hebben normale embryo’s 3 tot 5 serotonerge neuronen. (E,F)hbn mRNA in normale mesenchym blastulae (E) of in Six3 morfanten (F).Scale bar: 20 pm.
Omdat misexpressed Six3 kan de gehele APD uit te breiden en de ontwikkeling van ectopische neuronen te bevorderen, vroegen we welke genen in de E-APD genenset werden geupreguleerd, met behulp van microarray en QPCR metingen.Tabel 2 bevat 10 van deze genen waarvan de mRNA niveaus zijn verhoogd met ten minste 3-voudige in Six3 mRNA-geïnjecteerde embryo’s.
- View inline
- View popup
Genen geupreguleerd in Six3-misexpressie embryo’s
Six3 kan TGF-β signalering onderdrukken maar elimineert orale/aborale polariteit niet
Mexpressie van Six3 elimineert orale/aborale polariteit niet omdat orale enaborale ectoderm merkers worden uitgedrukt aan weerszijden van het embryo enneuronen normaal gevonden in de APD zijn beperkt tot een tussenliggende band.Nochtans vermindert misexpressed Six3 de expressie van nodale en ook die van lefty en chordin, in mesenchyme blastulae (Tabel 3, links), misschien omdat Six3 positieve input geeft aan de expressie van FoxQ2, waarvan is aangetoond dat het nodale expressie onderdrukt (Yaguchi et al., Verrassend genoeg onderdrukt Six3 de accumulatie van bmp2/4 mRNA niet zo sterk als het de nodale expressie vermindert, hoewel bmp2/4 expressie een nodale functie vereist in normale embryo’s (Duboc et al., 2004). Deze schijnbare paradox kan het gevolg zijn van een combinatie van verminderde Chordin-gemedieerde remming van BMP2/4 signalering gekoppeld aan diffusie van BMP2/4 en daaropvolgende auto-activatie, zoals is aangetoond in andere systemen (Biehs et al., 1996;Jones et al., 1992).
- View inline
- View popup
Six3 regulatie van signaalweg componenten
De gevoeligheid van vroege APD regulerende genen voor verlies van Six3.(A) Drie-dagen embryo’s geïnjecteerd met Δcadherin mRNA (boven) of metΔcadherin mRNA en Six3-MO (onder). De pijl geeft de oriëntatie van de dierlijke-vegetale as. Embryo’s zijn geïmmunostained met anti-serotonine en1e11, een pan-neurale merker. (B) QPCR cyclus veranderingen (blauwe en rode balken) of log2 signaalintensiteit verschillen (gele balken) (y-as, links) of vouw veranderingen (y-as, rechts) in de niveaus van de afzonderlijke mRNA’s in twee partijen (rode en blauwe balken) van Six3 morphant en controle 27-uur embryo’s, die beide Δcadherin. Genen waarvan de expressie ten minste 3-voudig is veranderd bevinden zich links van de groene lijn.
Canonieke Wnt, niet TGF-β, signalen te voorkomen APD uitbreiding in delaterale ectoderm
De signalen die de APD af te bakenen zijn afhankelijk van canonieke Wnt signalering, zoals de eliminatie kan de APD te omvatten bijna alle van het embryo (Yaguchi et al., 2006)(Fig. 1). Omdat Nodal en BMP afhankelijk zijn van canonieke Wnt signalen, hebben we beide TGF-β liganden geëlimineerd met een Nodal-MO (Yaguchi et al.,2008) om te testen of ze verantwoordelijk waren voor de Wnt-afhankelijke beperking van de APD. Fig.7B,F laat zien dat dit niet het geval is omdat serotonerge neuronen beperkt blijven tot de APD in deze embryo’s. Echter, wanneer Nodal morfanten worden voorzien van exogene Six3, dan serotonerge neuronen sterk in aantal toenemen en verschijnen in de hele dierlijke helft van het embryo (Fig. 7D), zoals wordt waargenomen inΔcadherin-misexpressie embryo’s (Yaguchi et al., 2006), die canonieke Wnt signalering verslapt. Daarom kan ectopische expressie van Six3 de andere signalen, vermoedelijk Wnt, opheffen die deze neuronen beperken tot deAPD van normale embryo’s.
Hoewel serotonerge neuronen zich niet vormen in het laterale ectoderm in Nodalmorphants, doen sommige niet-serotonerge neuronen dat wel (Fig. 7B). Dit is voornamelijk, zo niet uitsluitend, het gevolg van het verlies van BMP2/4 signalering, aangezien het resultaat wordt verkregen in BMP2/4-MO geïnjecteerde embryo’s (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.Aand R. D. Burke, ongepubliceerd). Omdat de ontwikkeling van alle neuronen afhankelijk is vanSix3 in het normale embryo, vroegen we of de ectopische neuronen in Nodalmorfanten ook afhankelijk zijn van Six3 door Nodal-MO en Six3-MO te injecteren. Zoals verwacht, gingen de serotonerge neuronen aanwezig op de dierlijke pool in Nodalmorphants verloren in de dubbelmorfanten (Fig. 7G,H). Deze embryo’s bevatten geen gedifferentieerde niet-serotonerge neuronen met axonale processen, hoewel sommige 1e11-immunoreactieve vlekken werden waargenomen. Deze kunnen wijzen op de aanwezigheid van onvolledig gedifferentieerde neuronen of weerspiegelen een initiële neurale bias van ectoderm cellen die normaal wordt overruled door TGF-βsignalering.
Six3 kan Wnt signalering tegengaan
Het feit dat de APD niet uitbreidt in Nodal morfanten maar wel inΔcadherine-geïnjecteerde embryo’s en dat Six3 canonieke Wnt-afhankelijke effecten in het laterale ectoderm kan overwinnen, doet de mogelijkheid rijzen dat Six3 Wnt signalering onderdrukt. Ter ondersteuning van deze hypothese vinden we dat Six3misexpressie de meeste genen die coderen voor Wnt-liganden en die tijdens de vroege ontwikkeling tot expressie komen, downreguleert (Tabel 3, links) (Fig. 8). Eén van deze genen is Wnt8, een cruciaal vegetaal signaal dat nodig is voor normale ontwikkeling van hetendomesoderm (Wikramanayake etal., 2004), een resultaat dat consistent is met het ontbreken van vegetale ontwikkeling in Six3-misexpressieve embryo’s. Samen suggereren deze resultaten dat de grenzen van de APD worden bepaald door Six3/Wnt antagonisme.
Six3 is niet voldoende om expressie van wnt en nodal in de APD te onderdrukken
Het vermogen van Six3 om (direct of indirect) genen die coderen voor Wnt liganden, evenals nodal, lefty en chordin, sterk te downreguleren, doet de mogelijkheid ontstaan dat het normaal gesproken expressie van deze genen in de APD voorkomt. Om dit te evalueren onderzochten we eerst de effecten van Six3 op de genexpressie in met Δcadherine geïnjecteerde embryo’s om mogelijke tegenwerkende effecten van de functie van Six3 in het endomesoderm uit te sluiten. Zowel microarray- als QPCR-gegevens tonen aan dat, in embryo’s die voor het grootste deel uit de APD bestaan, Six3 de expressie onderdrukt van de Wnt-genen, en van nodale, linkse enchordin (Tabel 3;Fig. 8). In normale embryo’s (glycerol-geïnjecteerd) kan echter geen Six3-onderdrukking van deze genen worden waargenomen (Tabel 3;Fig. 8), wat erop wijst dat bijkomende mechanismen de APD beschermen tegen Wnt- en TGF-β-expressie in het normale embryo.
Six3-regulatie van andere signaalwegen
Six3 reguleert ook (direct of indirect) genen die coderen voor proteïnen die functioneren in andere signaalwegen (Tabel 3). Dit omvatteelta, het Notch ligand dat laterale inhibitie medieert, een cruciaal proces in de neurale ontwikkeling, evenals andere potentiële regulatoren van neurogenese. Deze laatste omvatten fgf9/16/20, fgfr-achtig, een membraan-gebonden receptor zonder tyrosine kinase domein, en frizzled5/8, een Wnt-receptor die niet-kanonieke signalen kan doorgeven, maar waarvan de functie in de APD onbekend is (Croce et al., 2006). Toekomstige studies zullen onderzoeken hoe de activiteiten van deze signaalwegen en vroege Six3-afhankelijke transcriptiefactoren interageren in het APD genregulerend netwerk.
Misexpressie van Six3 converteert het embryo naar een uitgebreide APD. Allembryo’s zijn 3 dagen oud. (A) Normaal embryo, DIC; blastopore uitzicht, oralup. (B,C) six3 mRNA-misexpressie embryo’s, DIC; (B) mond-aanzicht, (C) lateraal aanzicht; pijlen in B geven de grens tussen de uitgebreide dierlijke plaat en de meer vegetale dun epitheel. (D,E) Serotonerge (sero, groen) en alle (1e11, magenta) neuronenin normale embryo’s. (F-H) DIC en immunokleuren, zoals in D en E van 63 mRNA-misexpresserende embryo’s; mond-aanzicht, dierpool omhoog. (I,I′) Immunokleuren van normale 3-daagse embryo’s voor NK2.1 (groen) en Gsc (magenta); (I) zijaanzicht; cellen in de APD rechts van de witte stippellijn; (I′) mond-aanzicht, cellen in de APD liggen tussen de gestippelde witte lijnen. NK2.1-positieve cellen gemarkeerd met pijlpunten bevinden zich in de blastocoel en maken geen deel uit van de APD; m, mond. (J-T) 63-mRNA-misexpressie embryo’s. (J,K) NK2.1 (groen); 1e11 (magenta). (L-N) NK2.1 (groen); Gsc (magenta). (O-Q) DIC beelden van hbnwhole-mount in situ hybridizaties op controle (O) en zes3mRNA-geïnjecteerde embryo’s (P,Q); dierlijke pool omhoog; witte cirkel in O markeert henouth. (R-T) Een door-focale serie van een embryo gekleurd met DAPI, en voor1e11 (groen) en Spec1 (magenta) epitopen; Spec1 labels de dunne, uitgebreidaborale epidermis die inzakt en rimpels in voorbereiding. (U) Diagram illustreert de verdeling van APD celtypes in normale enSix3-mRNA-misexpressie embryo’s. De gekleurde stippen tonen de verdeling van de cellen die de aangegeven eiwitten of mRNA’s en zwarte en paarse ovalenindiceren serotonerge (Sn) en niet-serotonerge neuronen (n-Sn), respectievelijk. Groene en blauwe arceringen identificeren gezicht epitheel en ciliated band, respectievelijk. Six3 mRNA injectie (pijl) resulteert in een bolvormige 3-daagse embryo (rechts; zie ook B, C) grotendeels bestaande uit de regio omlijnd in blauw in dan normale embryo (links). In de Six3-mis-expressie embryo, het aantal neuronen en NK2.1/gsc-positieve (geel; supraorale) cellen sterk uitgebreid en dehbn-positieve cellen (blauw), die normaal flankeren de dierlijke plaat aan de oralside in dit stadium, worden gevonden op de vegetale pool. De pijlen geven de posities van de orale-aborale en dierlijke-vegetale assen in zowel de normale enSix3-misexpressie embryo’s. Schaalstaven: 20 pm.