De Sanger Methode wordt gebruikt om een doelsegment van DNA te amplificeren, zodat de DNA-sequentie nauwkeurig kan worden bepaald. De incorporatie van ddNTPs in de reactiekleppen wordt eenvoudigweg gebruikt om de synthese van een groeiende DNA-streng te beëindigen, wat resulteert in gedeeltelijk gerepliceerde DNA-fragmenten. Dit komt doordat DNA-polymerase de 3′ OH groep van de groeiende keten en de 5′ fosfaatgroep van het inkomende dNTP nodig heeft om een fosfodiesterbinding tot stand te brengen. Soms zal het DNA-polymerase een ddNTP opnemen en zal de afwezigheid van de 3′ OH-groep de condensatiereactie tussen het 5′ fosfaat (na de splitsing van pyrofosfaat) van het inkomende nucleotide en de 3′ hydroxylgroep van het vorige nucleotide op de groeiende streng onderbreken. Deze condensatiereactie zou normaliter plaatsvinden bij de opname van een niet-gemodificeerd dNTP door DNA-polymerase. In de eenvoudigste bewoordingen leidt de nucleofiele aanval van de 3′ OH groep tot de toevoeging van een nucleotide aan een groeiende keten. De afwezigheid van de 3′-hydroxylgroep verhindert deze nucleofiele aanval, waardoor de DNA-polymerase niet langer in staat is zijn functie uit te oefenen.
Deze ontdekking leidde tot de toepasselijke naam “Chain-terminating nucleotides”. De dideoxyribonucleotiden hebben geen 3′ hydroxylgroep, zodat geen verdere ketenverlenging kan plaatsvinden zodra dit dideoxynucleotide zich op de keten bevindt. Dit kan leiden tot de beëindiging van de DNA-sequentie. Deze moleculen vormen dus de basis van de dideoxy-ketenbeëindigingsmethode voor DNA-sequencing, die in 1977 door Frederick Sanger en zijn team werd gerapporteerd als een uitbreiding van eerder werk. De aanpak van Sanger werd in 2001 beschreven als een van de twee fundamentele methodes om DNA-fragmenten te sequeneren (de andere is de Maxam-Gilbert methode), maar de Sanger methode is zowel de “meest gebruikte als de methode die door de meeste geautomatiseerde DNA-sequencers wordt gebruikt”. Sanger won zijn tweede Nobelprijs voor Scheikunde in 1980 en deelde deze met Walter Gilbert (“voor hun bijdragen aan de bepaling van basenvolgorden in nucleïnezuren”) en met Paul Berg (“voor zijn fundamentele studies van de biochemie van nucleïnezuren, met name met betrekking tot recombinant-DNA”), en besprak het gebruik van dideoxynucleotiden in zijn Nobellezing.
DNA-sequencingEdit
Dideoxynucleotiden zijn nuttig bij de sequencing van DNA in combinatie met elektroforese. Een DNA-monster dat een PCR (polymerasekettingreactie) ondergaat in een mengsel dat alle vier de deoxynucleotiden en één dideoxynucleotide bevat, zal strengen produceren met een lengte die gelijk is aan de positie van elke base van het type dat een aanvulling vormt op het type waarin een dideoxynucleotide aanwezig is. Het taq-polymerase dat in PCR wordt gebruikt, heeft een voorkeur voor het ddGNTP, een patroon dat in diverse onderzoeken is waargenomen. Dat wil zeggen dat elke nucleotide base van dat type een kans heeft om te worden gebonden aan niet een deoxynucleotide maar eerder een dideoxynucleotide, waardoor ketenverlenging wordt beëindigd. Als het monster dan elektroforese ondergaat, zal er een band aanwezig zijn voor elke lengte waarop het complement van het dideoxynucleotide aanwezig is. Het is nu gebruikelijk fluorescerende dideoxynucleotiden te gebruiken, zodat elk van de vier een verschillende fluorescentie heeft die door een sequencer kan worden gedetecteerd; er is dus maar één reactie nodig.